农药残留——得杀草检测方法

1．分析目标化合物

    得杀草、DMP 〔二甲基 3－（3,4,5,6－四氢－2H－吡喃－4－基）戊二酸酯〕、5-OH-DP 〔2[1－（3－氯丙基－2－（E）－烯－1－基）肟基丙基] －3,5－二羟基－5－（四氢化吡喃－4－基）环己基－2－烯－1－酮〕、OH－DMP 〔二甲基 3－羟基－3－（3,4,5,6－四氢－2H－吡喃－4－基）戊二酸酯〕

2．仪器设备

    气相色谱--质谱仪（GC/MS）。
    回流冷却器
    电热板（带有搅拌器） 

3．试剂

    甲醇

异丙醇

原甲酸三甲酯

过氧二硫酸钾

硫酸

过氧化氢：30％，特级
    氢氧化钠：特级

无水硫酸钠
    活性炭：化学分析用活性炭
    DMP标准品：含DMP 96％以上。
    OH-DMP标准品：含OH-DMP 96％以上。
   正己烷

乙酸乙酯
4．试验溶液的制备

    1）提取方法
    豆类和种子类：称取10.0g样品，加入20mL水，放置2小时。
    蔬菜：称取20.0g样品。
    加入150mL水：甲醇（1：4）混合溶液，均质后，抽滤。滤纸上的残留物中加入150mL水：甲醇（1：4）混合溶液均质，按上述同样抽滤。合并所得溶液，40℃以下浓缩至约30 mL。加入70 mL水后，加入300mL异丙醇。其150mL中加入5g氢氧化钠，缓缓摇动混合后，抽滤。用20mL异丙醇：水（4：1）混合溶液洗涤滤纸上的残留物，合并洗液到滤液中。
    2）氧化
    滤液中加入1g氢氧化钠，装上回流冷却管，在带搅拌器的电热板上搅拌、加热回流。沸腾后，从回流冷却管上端加入3mL过氧化氢，每隔10分钟再加3mL过氧化氢，重复操作3次后，再加热回流30分钟。
    3）活性炭吸附
    反应液冷却后，加入25g氯化钠，搅拌10分钟。加入20mL饱和氯化钠溶液，分取水层。异丙醇层中加入50mL饱和氯化钠溶液，激烈振荡5分钟后，静置，分取水层。合并水层，加入5mL盐酸，50～60℃下减压浓缩，除去异丙醇。
加水将析出的氯化钠溶解后，加入2.5g活性炭，激烈振荡10分钟后，抽滤。用200mL水洗涤滤纸上的活性炭后，抽滤5分钟。再用100 mL正己烷洗涤滤纸上的活性炭，抽滤5分钟。
    4）甲酯化
    滤纸和滤纸上的活性炭切除5mm角后，加入100mL甲醇，20mL硫酸，25mL原甲酸三甲酯、2 g过氧二硫酸钾，装上回流冷却管，在带搅拌器的电热板上搅拌、加热回流。沸腾1小时后，迅速抽滤。再用50mL甲醇洗涤滤纸上的残留物。接着，每次用50mL甲酸：甲醇（1：9）混合溶液，洗涤滤纸上的残留物2次。合并这些滤液和洗液，加入300mL水，每次用150mL二氯甲烷，振荡提取2次。提取液中加入50mL饱和碳酸氢钠溶液振荡，弃去水层。提取液中加无水硫酸钠脱水，滤去无水硫酸钠后，滤液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入1mL丙酮溶解，加入19mL正己烷。
    5）净化方法
    ① 合成硅酸镁柱色谱法
    在色谱管（内径15mm）中注入10g悬浮在正己烷中的柱色谱用合成硅酸镁，其上端再加入约5g无水硫酸钠。柱中注入4）所得的溶液，弃去流出液。接着，注入40mL丙酮：正己烷（1：19）混合溶液，弃去流出液。再注入100 mL丙酮：正己烷（1：4）混合溶液，流出液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入1mL乙酸乙酯溶解，加入19mL正己烷。
    ② 硅胶柱色谱法
    硅胶小柱（1000 mg）中注入5 mL正己烷，弃去流出液。柱中注入①所得的溶液，弃去流出液。接着，注入10mL乙酸乙酯：正己烷(3：17)混合溶液,弃去流出液。再注入25mL乙酸乙酯：正己烷（3：7）混合溶液，流出液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入1mL乙醚溶解，加入19mL正己烷。
    ③ 酰胺丙基甲硅烷基化硅胶柱色谱法
    酰胺丙基甲硅烷基化硅胶小柱(1000 mg)中注入5 mL正己烷，弃去流出液。柱中注入②所得的溶液，弃去流出液。再注入10mL乙酸乙酯：正己烷(3：7)混合溶液,流出液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入丙酮溶解，豆类和种子类样品准确至3 mL，蔬菜样品准确至6 mL作为试验溶液。

5．标准曲线的制作

    将DMP 和OH-DMP 标准品分别配制成丙酮溶液，按照1：1的比例混合后，配制成0.1～2 mg/L丙酮溶液数点，分别注入2 μL于GC/MS中，峰高法或峰面积法制成标准曲线。

6．定量

    注入2μL试验溶液于GC/MS中，由5的标准曲线求得DMP 和OH-DMP 的含量，再按下式，求得包括5-OH-DP及其相关化合物的得杀草含量。
    得杀草（包括5-OH-DP及其相关化合物）的含量＝DMP的含量×1.40＋OH-DMP 的含量×1.31

7．测定条件

    GC/MS
    柱：35％苯基-甲基硅酮，内径0.25mm，长30m，膜厚0.25μm。
    柱温：100℃（2 分钟）－3℃/分钟－200℃－30℃/分钟－280℃
    进样器温度：250℃
   检测器温度：280℃
    载气：氦气
    离子化电压：70 eV
    主离子：DMP m/z 213、182、168； OH-DMP m/z 175、155、143
    保留时间标准：DMP 29分钟； OH-DMP 32分钟 

8．定量限

    0.05 mg/kg

9．注意事项
    1）分析値
    将得杀草和5－OH－DP分别转化为DMP、OH－DMP后，分别对DMP、OH－DMP进行定量，每个的含量乘以系数换算为得杀草的含量，此为分析值。
    2）试验方法概述
    本方法是将得杀草、5－OH－DP及其相关的转化生成物，经氧化和甲酯化后，以DMP及OH－DMP为分析对象的检测方法。用水：甲醇混合溶液将得杀草、5－OH－DP及其转化生成物同时提取，氢氧化钙凝固处理后，经氧化反应它们转变为3－（3，4，5，6－四氢－2H－吡喃－4－基）戊二酸（GP）和3－羟基－3－（3，4，5，6－四氢－2H－吡喃－4－基）戊二酸（OH－GP）。接着经甲酯化，GP变成DMP，OH-GP变成OH-DMP，液液分配，用合成硅酸镁小柱、硅胶小柱和酰胺丙基甲硅烷基化硅胶小柱净化，GC/MS同时测定DMP和OH－DMP。
    3）注意点
    ① 氧化反应
    按照环境省告示的试验方法，加入1g氢氧化钾后，用30％过氧化氢作氧化剂，加热回流的方法进行氧化。
    小林ら报告了加入1g氢氧化钾、每隔10分钟加入3 mL 30％过氧化氢，共加4 次时，氧化效率最高，再继续加热回流30分钟使过量的过氧化氢分解。但是，氧化反应后溶液的pH在11～13反应能顺利进行，pH低氧化反应不进行的可能性大。取少量氧化反应后的溶液，用pH试纸确认pH值。pH偏低时，加氢氧化钾和30％过氧化氢再次进行氧化反应。
    ② 盐析后异丙醇的去除
    残存的异丙醇，会使活性炭的吸附率降低，必须完全去除。根据减压浓缩器冷却管上附着水滴、烧瓶内析出氯化钠和没有异丙醇气味判断异丙醇完全去除。
    ③ 活性炭的吸附
    按照环境省告示的试验方法，在氧化反应后的溶液盐析后的水层中加入活性炭振荡，使GP及OH－GP被活性炭吸附，抽滤和洗净。
    小林ら报告了GP 及OH－GP的水溶性高，转溶到一般的有机溶剂中较困難，但是，氧化反应后的溶液盐析和浓缩操作能完全去除有机溶剂，加入活性炭，GP及OH－GP能被吸附。
此外，残存的水分会降低甲酯化反应率。过滤后的活性炭需完全干燥。
    ④ 甲酯化
按照环境省告示的试验方法，活性炭中加入100mL甲醇后，加入2g过氧二硫酸钾，25mL原甲酸三甲酯和20mL浓硫酸，加热回流1小时进行甲酯化。
    小林ら报告了吸附在活性炭中的GP及OH－GP，GP能定量地转为DMP，因OH－GP的转变率较低，加入过氧二硫酸钾和原甲酸三甲酯使GP及OH－GP都能定量地转为DMP及OH－DMP。
    甲酯化后，为及时除去活性炭反应溶液在沸腾时应迅速抽滤，冷却后DMP及OH－DMP的回收率降低，应在温度高时迅速进行过滤。
    ⑤ 试验溶液的制备过程中，中断操作时，吸附在活性炭中的干燥状态可放置一晚，甲醇浸渍的状态放置2天。或者用饱和碳酸氢钠洗净后放置。