溶菌酶的溶菌作用

溶菌酶的杀菌机理是其作用于细菌细胞壁的粘肽层，粘肽是细菌的细胞壁主要成分。

溶菌酶能切断粘肽结构中的 N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β- 1,4糖苷键，破坏粘肽支架，使细胞壁破坏。由于细菌细胞壁的重要功能之一是保护细菌，即抗低渗，故细菌失去细胞壁的保护作用后，在低渗环境中可发生溶解。溶菌酶的主要作用对象是革兰氏阳性菌。革兰氏阴性细菌细胞壁粘肽层外还有脂多糖、外膜和脂蛋白结构，故在一般情况下溶菌酶不易发挥直接做用。

•  溶壁微球菌（ M.Lysodeikticus）：本菌是由空气中分离出的一种革兰氏阳性菌，对人不致病，菌落黄色，普通琼脂培养基生长良好，每月传代一次或冻干保存，用于制备溶壁微球菌琼脂平板。

•  标准溶菌酶：称取溶菌酶标准纯品，用 1/15mol.L -1 PBS配制为1000ug/ml原液，并稀释为100、50、10 ug/ml标准液，用前保存在冰箱中；用于阳性对照及制备标准曲线。

•  唾液：用无菌平皿收集唾液，可在同学间收集。

•  其它：无菌打孔器（孔径 2mm），无菌毛细吸管、米尺等。

•  用无菌打孔器在溶壁微球菌琼脂平板上打孔，用针头挑出孔内琼脂，孔径 2mm左右，孔距5-20mm。

•  用毛细吸管取新鲜收集的唾液加入琼脂孔内，每孔加一滴，每滴约有 0.025ml,同时加标准溶菌酶作阳性对照。

•  置 24-28 C°下12-18h观察结果。

用小米尺或三角板量取小孔周围溶菌环直径，并作记录，可与标准溶菌酶阳性对照作对比观察。

如需定量测定检品（唾液）中的溶菌酶含量，可将上述各种稀释度的溶菌酶标准溶液，分别加入小孔中，同法测定溶菌环直径，用半对数纸制成标准曲线，检品中的溶菌酶含量可从标准曲线上查出。

•  溶壁微球菌琼脂平板的制作：①溶壁微球菌在使用前于琼脂斜面上传代一次，然后接种于普通琼脂平板 ,37C°培养24小时，用1/15mol.L ^-1 PBS或无菌蒸馏水洗下菌苔，洗涤两次，2000r/min，离心30min，弃上清，称量沉淀物湿重, 用无菌蒸馏水配成100mg/ml的菌液。②称取优质琼脂粉1g加入1/15mol.L ^-1 PBS 100ml,制成1%琼脂。③取上述菌液1ml, 加入加热融化并放至50-60 C°的琼脂中，摇匀倾注平板。冷凝后即为溶壁微球菌琼脂平板。

•  1/15mol.L ^-1 PBS的制备：①1/15mol.L ^-1 KH₂PO₄: KH₂PO₄ 9.07g加蒸馏水至1000 ml；②1/15mol.L ^-1 Na₂HPO₄: 1/15mol.L ^-1 Na₂HPO₄11.87g加蒸馏水至1000 ml；③1/15mol.L ^-1 PBS(pH6.4)：取1/15mol.L ^-1 KH₂PO₄ 73ml加1/15mol.L ^-1 Na₂HPO₄27ml,加NaCL0.5g即为pH6.4的1/15mol.L ^-1 PBS。