工业微生物产生菌的筛选（六）

（三）利用平皿的生化反应进行分离

这是一种利用特殊的分离培养基对大量混杂微生物进行初步分离的方法。分离培养基是根据目的微生物特殊的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计的。通过观察微生物在选择性培养基上生长状况或生化反应进行分离，可显著提高菌株分离纯化的效率。

1. 透明圈法

在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊。能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应该菌株利用底物的能力。该法在分离水解酶产生菌时采用较多，如脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶、核酸酶产生菌都会在含有底物的选择性培养基平板上形成肉眼可见的透明圈。在分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂，根据菌落周围是否出现透明的水解圈来区别产酶菌株。如要分离该酸水解酶产生菌，可用双层平板法，首先在普通平板培养基上把悬浮液涂抹培养，等长出菌落后覆盖一层营养琼脂，内含3%酵母RNA，0.7%琼脂及0.1mol/LEDTA，pH7.0，于42℃左右培养2～4h,四周产生透明圈的菌落，即为核酸分解酶产生菌。

在分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法进行初筛。在选择性培养基中加入碳酸钙，使平板成混状，将样品悬浮液涂抹到平板上进行培养，由于产生菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈，可以轻易地鉴别出来。分离乳酸产生菌时，由于乳酸是一种较强的有机酸，因此，在培养基中加入的碳酸钙不仅有鉴别作用，还有酸中和作用。

2. 变色圈法

对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使所需微生物能被快速鉴别出来。如筛选果胶酶产生菌时，用含0.2%果胶为惟一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。在分离谷氨酸产生菌时，可在培养基中加入溴百里酚蓝，它是一种酸碱指示剂，变色范围在pH6.2～7.6，当pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。若平板上出现产酸菌，其菌落周围会变成黄色，可以从这些产酸菌中筛选谷氨酸产生菌。

在进行解脂微生物的分离时，虽然有很多精确的测定方法，如酸碱滴定法、电位滴定法、浊度滴定法、甘油滴定法及色谱分析法等，但由于步骤繁琐，不适于大规模筛选测定。为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色圈法，如以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。最常使用的方法是把恶秦染料中的维多利亚蓝和脂类底物混合，制成维多利亚蓝乳脂琼脂培养基平板，起始培养基调为中性，当土壤样品的悬浊液分离在平板上，具有脂解能力的 菌落产生的脂肪酶水解油脂底物，使pH值由中性下降到微酸性或酸性，阳性解脂反应能显示粉红到蓝色的变化。如培养基起始pH为碱性，则阳性解脂反应从咖啡色到蓝绿色，能使脂类底物和解脂后的脂肪酸区别开来。后来又由Fryer等研究出一种改良的双层法，先在平皿内倒一层营养琼脂，把一张棉纸圆片在被维多利亚蓝染了色的乳脂中浸湿，铺在已凝固的琼脂表面，然后覆盖一薄层含样品的营养琼脂，保温培养，解脂菌落就可以在棉纸中产生蓝带。

分解解脂细菌的培养基（%）为：牛肉膏0.5、蛋白胨0.5、琼脂2.0、大豆油5.0、维多利亚蓝4mg。

分离内肽酶产生菌，除了用酪蛋白作底物平板产生透明圈进行鉴别外，还可以用吲羟乙酸酯为底物加到分离培养基中，产生蛋白酶的菌落由于水解吲羟乙酸酯为3-羟基吲哚，后者能氧化生成蓝色产物，根据呈色圈便可选出平板上产蛋白酶的菌落。培养基平板由两层组成，底层含明胶1.2％，酵母汁0.1％，蛋白胨0.4％，琼脂1.5％，待凝固后在其上覆盖一层琼脂，琼脂含量为0.7％，由pH7.6的0.5mol/L的磷酸氢钾缓冲液配制，配制浓度为0.083mol/L的吲羟乙酸酯溶液，取其中的0.3ml加入到上层琼脂中倒平板。
通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙醇的菌株。在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。

3. 生长圈法

生长圈法通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌。工具菌是一些相对应的营养缺陷型菌株。将待检菌涂布于含高浓度的工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围周围便会形成一个混浊的生长圈。如嘌呤营养缺陷型大肠杆菌（如E.coliP264）与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌。

同样，只要是筛选微生物所需营养物的产生菌时，都可采用生长圈法，工具菌用 相应的营养缺陷型菌株，由于得到所需营养，凡是目的微生物周围便会出现混浊的生长圈。

4. 抑菌圈法

常用于抗生素产生菌的 分离筛选。通常抗生素的筛选要投入极大的人力、财力和时间。据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的生产菌。因此设计一个准确、迅速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制菌生长的 物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。采用该方法已经得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。

在青霉素菌种选育中，还可利用加入青霉素酶来筛选青霉素高产菌株，做法如下：将产黄青霉孢子进行诱变处理，致死率约为99%。分离于琼脂平板上，控制孢子浓度，使长成独立菌落，一直培养到青霉素产量达到顶峰，加入0.106U/mol青霉素酶于鉴定菌枯草芽孢杆菌悬浮液中，铺张于菌落平板表面，凝固后，培养17～20h。测量抑菌圈大小，根据有效指标（抑菌圈直径于菌落直径之比）选出高产突变株。

由于现有抗生素种类多样，得到新的抗生素越来越困难。人们除了从一些特殊的 地方如极端环境中采样分离抗生素的 产生菌，也采用一些特殊的筛选方法，以期从普通土样中分离筛选倒新的微生物及新的抗生素。除上述的抑菌圈外，稀释法、扩散法、生物自显影法等也不同程度的得到应用。在这些方法中，检验菌的选择十分重要，直接关系到检出的灵敏度和筛选到的抗生素的活性和抗菌谱。如在筛选抗细菌抗生素时，传统上常用金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌作为检验菌来检验抗生素的抗性。采用联合检验菌，如枯草杆菌和绿色产色链霉菌活巴氏梭菌，可分离出抗菌活性低、对其他试验菌活性高的新抗生素，如黄色霉素族的抗生素，而这些抗生素在单独使用枯草杆菌时无法检出。

海洋是新抗生素的重要来源。许多海洋生物体内都含有微生物，这些微生物为宿主抵御病害起着关键作用。因此，从鱼组织和虾消化道里分离筛选抗癌药物和抗炎症药物是一个有效地途径。已从水母体内筛到一种名为salinamide的抗生素，一种抗真菌抗生素istatin也从海洋生物体中分离出。

在筛选抗霉菌抗生素时，需根据其特点进行筛选，因霉菌与哺乳动物细胞性质相似，为减少药物对人体的副作用，需挑选对霉菌有抗性但对人体安全的抗生素。由于哺乳动物不含几丁质，因此可先筛选抑制几丁质合成酶的生理活性物质，再从中筛选所需抗生素。三国霉素和多氧菌素就是通过该方法筛选得到的。抗病毒抗生素及抗肿瘤药物的筛选则可通过敏感细菌培养平板的噬菌斑来判断。

采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，而且还能筛选某些酶类。