细菌检验工作的基本技术——葡萄球菌属

注： a．葡萄球菌属、动性球菌属、口腔球菌属、微球菌属皆隶于微球菌科。

b．符号：+，90％以上阳性；土，90％以上弱阳性；一，90％以上阴性；d，1l％一89％阳性；ND，未试验；(   ) 迟缓反应。

c．在某些菌种中出现触酶弱阳性或假阳性反应，是由于在培养中补充血红素，活化某些菌株触酶活性。

d．Faller和Schleifer改良氧化酶试验为检出细胞色素C。

e．标准的氧化—发酵试验。

f．+，耐药或无抑菌环，微球菌、口腔球菌、气球菌敏感，抑菌环10～25mm。

g．十，耐药或抑菌环≤9mm；一，敏感，抑菌环15～35mm。

h．表皮葡萄球菌有些菌株生长时紧固地粘附于琼脂表面，此种特性与细菌产生浓的粘液相关。

 

1．与链球菌鉴别：葡萄球菌与链球菌的区别如下：在镜下，葡萄球菌以单、双、葡萄状排列，菌体呈圆形。链球菌以成单、双、链状排列，菌体形态为圆形或椭圆形。葡萄球菌触酶试验阳性，链球菌则阴性。

2．与微球菌的鉴别：实验室常用的鉴别依据是形态和发酵葡萄糖产酸。在镜下，葡萄球菌以葡萄状排列为主，菌体较小；微球菌以四联排列为主，且菌体较大。葡萄球菌发酵葡萄糖产酸试验阳性，微球菌阴性。此外杆菌肽、呋喃唑酮敏感试验有利区别两属菌种。

目前葡萄球菌已被命名有27个种。临床标本中最常见有意义菌种是金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、溶血葡萄球菌、里昂葡萄球菌、施氏葡萄球菌、中间葡萄球菌和猪葡萄球菌。首先用凝固酶试验将其分为凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌(包括中间和猪葡萄球菌)和凝固酶阴性的其他葡萄球菌，然后用新生霉素敏感试验。推断新生霉素耐药为腐生葡萄球菌。下表列出了关键鉴定试验来区别上述8个菌。

试剂：3％H₂O₂溶液，置棕色瓶内于4℃阴暗处保存。

方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3％过氧化氢溶液1～2滴。静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。

 

 表             有临床意义的8种葡萄球菌关键性鉴定

 

注意点：       1．注意过氧化氢为3％，应用30％浓的H₂O₂，用时稀释10倍。

      2．不应在培养基上做试验。

      3．每次试验时，应以阳性和阴性菌株做对照。

 

葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。

1．凝聚因子试验：取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合，10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过 10s可出现假阳性，有10％一15％金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。

操作过程中的注意点：

(1)    10s内观察结果。

(2)    必须制备浓厚的均匀菌悬液。

(3)    用EDTA抗凝的兔血浆为最好。

(4)    加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。

(5)    生长在高盐培养基上的菌落可出现自凝或假阳性。

2．葡萄球菌凝固酶试验：用生理盐水将血浆4倍稀释，取0.5ml。然后挑取3～5个菌落于稀释血浆中，成浓菌悬液。置37℃水浴，3～4h后读取结果，凝固者为阳性。若阴性，继续观察到24h，不凝固者为阴性。试验应同时作阳性、阴性对照。

试管法葡萄球菌凝固酶试验阳性者，应见到明显的纤维蛋白凝胶块，出现羊毛状或纤维状沉淀物并非真正凝固，应判为阴性。中间型葡萄球菌、猪葡萄球菌需要较长时间孵育，才可出现阳性。凝固酶试验应考虑下述情况：

①     某些金黄色葡萄球菌产生溶纤维蛋白酶，溶解纤维蛋白凝块。

②     所用血浆缺乏纤维蛋白原。

③     试验菌株不纯。

 

葡萄球菌的OF试验应使用专用配方，不可与非发酵菌用的OF管混用。培养基用的指示剂必须用水配制，因为个别菌株能分解乙醇产酸。

培养基：

    酵母浸膏                        0.1g

    胰胨                               1g

    牛肉浸液                        l00ml

    0.2％溴甲酚紫溶液         lml

校正pH7.0，按常规方法加入1％的碳水化合物，分装，灭菌，备用。

溴甲酚紫的配制：溴甲酚紫lOOmg， 0.01mol的NaOH 18.5ml，加水至50ml。

方法：挑取待检菌落，接种于2支O-F培养基管中，发酵管加灭菌液体石蜡油约 lcm深，氧化管不加。35℃孵育24h后观察，培养基变黄即产酸。结果判定如下：

 

 

方法：挑取待检菌菌落数个，制成相当 0.5号麦氏管(McFarland)浓度菌液，棉拭子浸透，挤去多余液，均匀涂在M—H平板上，贴上含5ug／片的新生霉素纸片，35℃孵育 16～20h，抑菌环直径≤16mm为阳性(耐药)。试验时应以金黄色葡萄球菌 ATCC25923做阴性(敏感)对照，以确认纸片是否有效。

 

试剂：

四甲基对苯二胺 (TMPD)  (Tetramethylphenylenediamine)    6.0g

二甲基亚砜 (DMSO)      (Dimethy sulfoxide)                    100.0ml

溶解TMPD于DMSO中，置于避光玻塞瓶中，可在室温中保留几个星期。

方法：被检菌株移种于7％羊血琼脂上，30℃需氧条件下孵育15～18h，刮取菌落涂布于无色滤纸片上，加1滴上述试剂，阳性者在2min内呈深蓝色。

若被测菌株移种在蛋白胨酵母浸出液琼脂上，至少孵育3天以上，才可检测，阳性反应5～10min出现。