细菌检验工作的基本技术——肠杆菌科（下）

二、试验方法（2010.07.14-2）

(一)硝酸盐还原试验

      培养基：

                  蛋白胨    1g

                  硝酸钾    0.1g

蒸馏水    l00ml

将上述成分溶于蒸馏水，校正pH为7.4～ 7.6，分装，高压灭菌121℃15min，冷却后备用。

    试剂：

                  A液：

                         对氨基苯磺酸              0.8g

                         5N醋酸                100ml

                  B液：

                         α-萘胺               0.5g

                         5N醋酸             l00ml

方法：将待检菌接种硝酸盐培养基中，孵育过夜，加入等量A、B液1～3滴，观察结果。

结果：红色为“+”，即还原硝酸盐。

注意点：

    1．培养基不应含亚硝酸盐，以避免假阳性。

2．某些肠杆菌还原硝酸盐的能力很强，还原硝酸盐为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解为氨、氮、氧化氮，造成假阴性。所以，观察结果时，如无红色出现，应加少量锌粉，仍无色，说明亚硝酸盐进一步分解，硝酸盐反应为阳性。若加锌粉后出现红色，说明锌使硝酸盐还原为亚硝酸盐，而待检菌无还原硝酸盐的能力，即硝酸盐还原试验阴性。

 

(二)甲基红试验

培养基：

             葡萄糖               0.5g

             多价蛋白胨        0.5g

             磷酸氢二钾        0.5g

             蒸馏水               100ml

将上述成分溶于蒸馏水，校更pH为 7.2，分装，高压灭菌121℃10min，冷却备用。

试剂：甲基红 0.1g溶于95％乙醇 300ml，然后加蒸馏水至500ml。

方法：将待检菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育过夜，加甲基红试剂1～2滴，观察结果。

    结果：红色为阳性，桔黄色为阴性。

 

(三)MIU培养基(动力-靛基质-尿素)

培养基：

             胰蛋白胨                  1g

             NaCl                  0.75g

             磷酸氢二钾        0.2g

             葡萄糖               0.1g

             琼脂                         0.4g

             蒸馏水               l00ml

             0.4％酚红          适量

             20％尿素                  10ml

将上述成分(尿素除外)溶于蒸馏水，加适量0.4％酚红，高压灭菌116℃20min，20％尿素过滤除菌，加入灭菌后的培养基中，分装、备用。

方法：将待检菌穿刺接种于MIU培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：    动力“十”，穿刺线周围扩散生长。

培养基变红为尿素阳性。

                         加靛基质试剂变红为吲哚阳性。

 

(四)拘橼酸盐试验(Simmons法)

培养基：

             氯化钠                             5g

             硫酸镁                             0.2g

          磷酸二氢铵                      1g

                  磷酸氢二钾                      1g

                  枸橼酸钠                                2g

                  蒸馏水                             1000ml

                  0.2％溴麝香草酚蓝            40ml

将上述成分溶于蒸馏水，校正pH7.0，加溴麝香草酚蓝指示剂，高压灭菌121℃ 15min，分装，备用。

方法：将待检菌接种于培养基中，孵育过夜，观察结果。

结果：有细菌生长培养基变蓝色为阳性，无颜色改变为阴性。

    

(五)氨基酸脱羧试验

    培养基：

                  蛋白胨                             5g

                  酵母浸膏                                3g

                  葡萄糖                             1g

                  溴甲酚紫(1.6％溶液)        lml

                  蒸馏水                             1000ml

                  L—氨基酸                       0.5％

将上述成分(除氨基酸外)溶于蒸馏水，然后加氨基酸，校正pH6.7～6.8，分装，高压灭菌121℃lOmin，备用。用于对照的不加氨基酸。

方法：取待检菌接种于氨基酸脱羧培养基和对照管中，封石腊油，35℃培养过夜，观察结果。

结果：培养基变紫色为阳性，黄色为阴性。对照管应保持黄色。

注意点：

    1．培养基的pH值很重要。

    2．加封石腊油造成厌氧环境。因为在厌氧情况下氨基酸脱羧生成的胺才稳定。

    3．对照管如不呈黄色，则氨基酸脱羧酶试验不能作出判定。

   

(六)葡萄糖酸盐试验

    培养基：

                  蛋白胨               1.5g

                  酵母浸膏                  1g

磷酸氢二钾       1g

葡萄糖酸钾       40g

蒸馏水              1000ml

上述成分溶解、过滤，校值更pH6.5，分装每管lml，高压灭菌115℃15min，冷却，备用。

试剂：班氏试剂。

大量接种待检菌于培养基中，35℃孵育过夜或至48h，加班氏试剂，水浴中煮沸 lOmin观察结果。

结果：有黄色到橙色出现为“+”，没有颜色变化为“一”。

 

(七)糖、醇发酵试验

培养基：

             蛋白胨                      l0g

             肉膏                                3g

             氯化钠                      5g

             Andrade指示剂         l0ml

             蒸馏水                      1000ml

将上述成分溶于蒸馏水，加糖或醇，校正 pH7.1～7.2，分装，高压灭菌121℃15min。冷却备用。

葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露醇的浓度为 1％。其他糖类和卫矛醇、水杨苷等的浓度为 0.5％。

乳糖、蔗糖和阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等二糖应过滤除菌，再加入于已灭菌的基础液中。

Andrade指示剂：

             蒸馏水                             l00ml

             酸性复红                                0.5g

             lmol／L氢氧化钠              16ml

将复红溶解于蒸馏水，加入氢氧化钠，数小时后，如复红褪色不够，再加l～2ml氢氧化钠，使呈淡黄色。

方法：接种待检菌，35℃孵育过夜，观察。

结果：培养基变红色为阳性，不变色或黄色为阴性。

 

(八)苯丙氨酸脱氨试验

培养基：

                  DL-苯丙氨酸    2g    (L-型1g)

                  酵母浸膏                  3g

                  氯化钠               5g

                  磷酸氢二钠        1g

                  蒸馏水               1000ml

将上述成分溶于蒸馏水，分装，高压灭菌 121℃15min，冷却，备用。

试剂：10％三氯化铁溶液。

方法：将待检菌接种于培养基，35℃孵育过夜，加三氯化铁试剂，观察结果。

结果：培养基变绿色为阳性，不变色为阴性。