微生物基因表达的调控

目前常用的三种体外 DNA 连接方法为：

① 用 T4或 E.coli DNA连接酶可连接具有互补粘性末端的 DNA片段；

② 用 T4 DNA连接酶连接具有平末端的 DNA 片段；

③ 先在 DNA 片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，然后再行连接。

④ 将粘性末端补平或修平（用单链酶，如绿豆芽核酸酶）连接

 

柯斯质粒用于克隆大片段的 DNA分子特别有效，而这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。其特点： 

1）具有 λ噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对 λ噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。进入寄主的柯斯质粒 DNA分子，按照 λ 噬菌体 DNA的方式环化， 但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。 

2）具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。 

3）具有高容量的克隆能力：柯斯质粒本身一般只有 5～7kb左右，而它克隆外源 DNA 片段的极限值竟高达 45kb，远远超过质粒载体及 λ 噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，  柯斯质 粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。  例如，5 kb大小的 柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于 30 kb。 

 

M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状 ssDNA，  大小为 6407bp。其生活史为： 

1）通过性毛感染雄性（F+或 Hfr）大肠杆菌，或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞； 

2）进入细胞后，转变成复制型  (RF)  dsDNA，然后以滚环方式制出 ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。 

M13克隆载体是对野生型 M13进行改造后建成，其特点是虽然克隆外源 DNA的能力较小，一般只适于克隆 300～400bp 的外源 DNA 片段，但特别适合用于制备克隆基因的单链 DNA。主要被用于制备测序用单链 DNA模板、特异的单链 DNA探针，进行定位诱变等，也可用于噬菌体展示。