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发根农杆菌对植物的Ri质粒转化与表达(一)



录入时间:2010-8-6 15:28:31 来源:易生物

     转基因植物在近代工业、医药业、特别是农业等各个领域的研究和应用越来越为人类所重视。通过农杆菌对植物植株、器官、组织及细胞的侵染进行质粒转化,是将外源基因导入目的植物的重要方法之一。本实验使同学了解农杆菌对植物质粒转化的基本原理及具体操作过程,从而对转基因植物的产生和外源基因转入植物后产生的特殊性状具有更加感性的认识。

      将外源基因人为导入天然植物中,从遗传物质水平上对植物进行有目的改造,由此获得转基因植物,其性状将按着有利于人们需要的方向发生改变。如转基因的抗虫棉花,通过人们的改造,使棉花在生长过程中体内能够自主地产生抵抗害虫的毒素,以达到自我保护、减少农药使用增产增收的目的。

   随着科学家的不断探索,将人们获得的有用基因转入目的植物方法发展较快,现有农杆菌介导法、基因枪轰击法、细胞显微注射法、花粉管真空渗透法、化学法及电穿孔法等,其中农杆菌介导法是今仍然广泛使用的一种有效转化方法。农杆菌介导法所使用的质粒载体分根癌农杆菌和发根农杆菌两大类。

通过发根农杆菌的侵染向目的植物转入Ri质粒中的T-DNA,可使培养植物发生变态性的生长,专一性生长毛状的发状根。通过植物基因改造获得的发状根生长迅速且培养时不需要添加外源激素,同时发状根拥有亲本植株的特征次级代谢途径和遗传稳定性,几乎无培养的退化问题,这些特点对植物生物工程的研究与应用具有重要的现实意义,例如通过发状根培养来生产只有在高度的根趋向分化细胞中才能产生的有用次生代谢物质等。

 发根农杆菌是一种寄主非常广泛的土壤细菌,能够浸染几乎所有的双子叶和少数的单子叶植物。其有不同的菌株,各自对一些相应的植物品种具有较强的侵染性,如A4 9402 Ar.15834等。发根农杆菌感染植物伤口,经一段时间后被感染的植物会在不定的部位生出发状根。发状根没有向地性,可在无激素的培养基上培养生长,生长迅速并产生许多分枝,其增长速度一个月可增殖数倍到数百倍。发根农杆菌对植物的这种作用主要依赖于其菌体中的Ri质粒。

Ri质粒具有普通的质粒的特点:是细菌染色体外的遗传物质,能独立复制,为闭合环状双链DNA。它是非必要的遗传物质,一般控制细菌的次要性状,可自我复制并具有遗传的稳定性,在特殊环境中对细菌的生存起着重要的作用。它具有可转移性、可重组性、可整合性、可消除性等特点。Ri质粒的环状基因可按功能可分为Vir、T-DNA、Ori三个区,该三个功能区在对植物的浸染与表达中分工明确。

Vir区的作用:该区基因不发生转移,但它在T-DNA转移的过程中起着十分重要的作用,这个区的缺矢或突变会使发根农杆菌的菌株丧失对植物的侵染能力。Vir区7个基因群(A-G)的A一直处于活性表达状态而其它的6个基因通常情况下处于抑制状态。发根农杆菌感染寄主时,被损伤的植物细胞会合成特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等,此时其可以与Vir区A基因的表达产物结合,诱导其它的联合基因的活化,从而发生感染过程。

T-DNA区的特点与功能:T-DNA区的基因群具有致使发状根产生(包括生长素合成)的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因以及某些抗性标记基因和特殊的酶切位点。其在侵染的过程中转移到寄主的细胞中与其DNA相整合,从而随寄主细胞中的DNA进行复制和表达。由于真核细胞中才具有T-DNA区的基因群中某些基因(如生长素合成的有关基因、冠瘿碱合成的有关基因等)的功能启动子,因而这些基因只能在寄主真核细胞中转录表达,在农杆菌中处于抑制状态。

Ori区的功能:在农杆菌中启动质粒DNA的复制。

发根农杆菌将T-DNA转入寄主的过程:首先受伤的植物从伤口处产生特殊的小分子酚类化合物乙酰丁香酮等,与Vir区A基因的表达产物结合,诱导其它的联合基因的活化,从而发生感染过程,T-DNA区的两端先后单链短裂,短裂下来的单链T-DNA被转移到植物细胞中与植物的基因组随机的整合,Ri质粒中移走的T-DNA区通过DNA复制得到修复,因此尽管发生了单链T-DNA的转移,发根农杆菌细胞没有因此丧失任何遗传信息。

 

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