发根农杆菌对植物的Ri质粒转化与表达(二)

本实验正是通过A₄发根农杆菌的介导，对烟草、油菜、甘蓝等植物进行基因的改造，得到它们的发状根。

1菌种：发根农杆菌A4 （抗利福霉素）

2器材：超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、光照培养箱、恒温震荡摇床、pH酸度计、电子天平、培养皿（6-9cm）若干套、1000ml烧杯2只、容量瓶（10、50、100、500、1000ml）各1只，三角瓶（100ml）20只，玻璃棒若干只，酒精灯一只，铝箔、称量纸、长剪刀、解剖刀、长镊子、接种针、移液枪（10、200、1000μl）各1只

 

3药品：

配制MS植物基本培养基药品：NH₄NO₃ 、KNO₃ 、CaCl₂ 、MgSO₄7H₂O、 KH₂PO 、KI、H₃BO₃ 、MnSO₄.7H₂O、 ZnSO₄.2H₂O、Na₂MoO₄.2H₂O、 CuSO₄.5H₂O、CoCl₂.6H₂O、CoSO₄.7H₂O、 FeSO₄.7H₂O、Na₂.EOTA.2H₂O、肌醇、烟酸、盐酸吡哆醇、盐酸硫胺素、甘氨酸、蔗糖、琼脂

配制LB细菌培养基药品：胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、琼脂

抗生素药品：利福霉素、氨苄青霉素、头孢霉素

 

1、植物无菌外植体的获得：

将实验的最初种子材料包于医用纱布，用自来水冲洗过夜后用无菌水漂洗三次，浸入75%乙醇表面处理1分钟，再用10%NaClO表面消毒10-15分钟，经无菌水漂洗5次后接种于盛有无激素MS固体基本培养基（MS₀）的培养皿中，28℃下暗培养。及时将未污染的发芽种子转接到盛有MS₀固体培养基的培养皿中继续28℃光照培养，一周后可得到无菌种子幼苗。然后将幼苗转接到盛有MS₀固体培养基的的100ml三角瓶中28℃光照培养15-20天，得到无菌种子苗植株。

2、A₄发根农杆菌纯化筛选极其工程菌液的制备

将A₄发根农杆菌原种接入LB液体培养基中28℃摇床扩增培养40-50小时，以0.3ml的接种量平铺接种于含有利福霉素40mg/L的固体LB平板培养基上（9cm培养皿），28℃ 培养60-80小时进行菌种的纯化筛选。将纯化筛选得到的A₄发根农杆菌单菌落接种于LB液体培养基中增殖培养40-50小时至光密度达到0.5，制备成工程菌液。

3、 A₄发根农杆菌对外植体侵染诱导产生发状根

切取无菌苗的下胚轴及叶片，将其倒置接于MS₀固体培养基上（使切口向上），用移液枪吸取工程菌液轻点接菌在下胚轴及叶片叶柄的切口上（同时以移液枪吸取无菌水轻点接在下胚轴及叶片叶柄的切口做为对照），暗培养2-3天后转到含有500 mg/L头孢霉素的固体MS₀培养基上继代培养7-14天后从切口、胚轴及叶脉等处均可诱导出大量的发状根。

4、 Ri-质粒转化的初步判断

根据发状根的几项重要的生物学特性来初步判断Ri-质粒转化（一）发状根的发生多在母体植物的不定部位。通过A₄发根农杆菌侵染，以在叶片上特别是叶片无切伤处生出的不定根判断极有可能是Ri-质粒转化得到的发状根，切取其进行除菌，并进行进一步验证。（二）发状根多表现为较弱的向地性。以对照的生出的不定根与侵染后叶片无切伤处生出的不定根做比较。对照生出的不定根在母体上具有很强的向地生长现象，而侵染后叶片无切伤处生出的不定根无论在母体外植体上还是离体培养中都应表现出很弱或不表现向地生长的现象。以此来对侵染后叶片无切伤处生出的不定根做进一步的判定。（三）由于转入植物的T-DNA在植物细胞中可表达产生植物激素，因而发状根在无激素的培养基上生长正常以及较快。同样以对照生出的不定根与侵染后叶片无切伤处生出的不定根做比较。对照的生出的不定根刚离体后在MS₀培养基上生长极为缓慢甚至停止生长；叶片侵染后无切伤处生出的不定根离体后在MS₀培养基上继代多次后仍然生长较快。由上可初步判断叶片侵染后无切伤处生出的不定根是Ri-质粒转化得到的发状根。

5、 发状根的除菌及其固体培养体系的建立

要建立起正常的发状根培养体系必须经过除菌获得无菌的发状根。以抗生素除菌和温度除菌相结合的方法进行除菌。抗生素除菌，即将发状根从母体上切下后移植到含有抗生素的培养基上，经数代转移直到完全无菌为止。温度除菌，即将发状根从母体上切下后移植到不含有抗生素的培养基上，在 39-40℃温度条件下处理2天后再移到28℃下培养，发状根恢复生长而细菌不在生长，完全达到除菌的目的。由于新生的发状根前端细菌较少，因而除菌时将培养的发状根前端及时地剪切下来转移到新的培养基上，将极大的有利于细菌的去除。

经2-3次抗生素与温度的结合除菌，得到的烟草发状根细菌完全除净且在MS₀固体培养基上生长正常，每4-5周可继代1次。

6、 发状根液体培养体系的建立

 将已经过除菌的各发状根株系在MS₀固体培养基上扩增培养并筛选，筛选生长正常且生物量增长快的株系进行继代扩增至一定的生物量后转入盛有MS₀液体培养基的250ml三角瓶中28℃摇床暗培养，摇床转速120rpm，培养20-30天即可得到一系列烟草发状根液体培养体系。

 

附录：

（1）LB细菌培养基配制方法

配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入：

细菌培养用胰化蛋白胨（bacto—tryptone）：10g

细菌培养用酵母提取物（bacto— yeast extract）：5g

NaCl：10g

摇动容器直至溶质完全溶解，用5mol/L NaOH（约0.2ml）调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1L，在15 lbf/in²(1.034x10⁵Pa)高压下蒸汽灭菌20分钟。

（2）MS植物基本培养基配方表