微生物菌种常规保藏技术规程（4）

附    录C

沙土管保藏法

 

C.1   适用范围

本方法适用于产孢类放线菌、芽孢杆菌、曲霉属、青霉属以及少数酵母如隐球酵母和红酵母等。不适用于病原性真菌的保藏，特别是不适于以菌丝发育为主的真菌的保藏。

C.2   原理

干燥条件下微生物菌种代谢活动减缓，繁殖速度受到抑制。此方法可减少菌株突变，延长存活时间。

C.3   方法与步骤

C.3.1   沙土管制备

将河沙用60目过筛，弃去大颗粒及杂质，再用80目过筛，去掉细沙。用吸铁石吸去铁质，放入容器中用10%盐酸浸泡，如河沙中有机物较多可用20%盐酸浸泡。24小时后倒去盐酸，用水洗泡数次至中性，将沙子烘干或晒干。另取瘦红土100目过筛,水洗至中性，烘干，按沙∶土=  2∶1混合。把混匀的沙土分装入安瓿管或小试管中，高度为1厘米左右。塞好棉塞，0.1MPa灭菌30分钟，或常压间歇灭菌3次，每天每次1小时。灭菌后在不同部位抽出若干管，分别加营养肉汁、麦芽汁、豆芽汁等培养基，经培养检查后无微生物生长方可使用。

C.3.2   斜面培养物的制备

参照附录A。

C.3.3   制备菌悬液

向培养好的斜面培养物中注入3mL-5mL无菌水，洗下细胞或孢子制成菌悬液。用无菌吸管吸取菌悬液，均匀滴入沙土管中，每管0.2mL -0.5mL。放线菌和霉菌可直接挑取孢子拌入沙土管中。

C.3.4   干燥

用真空泵抽去安瓿管中水分并放置于干燥器内。

C.3.5   纯培养检查

从做好的沙土管中，按10∶1比例抽查。无菌条件下用接种环取出少量沙土粒，接种于适宜的固体培养基上，培养后观察其生长情况和有无杂菌生长。如出现杂菌或菌落数很少，或根本不长，则须进一步抽样检查。

C.3.6   保藏

将纯培养检查合格的沙土管用火焰熔封管口。制好的沙土管存放于低温(4℃-15℃)干燥处，半年检查一次活力及杂菌情况。也可将纯培养检查合格的沙土管直接用牛皮纸或塑料纸包好，置干燥器内保存。用此方法保藏时间为2-10年不等。

C.3.7   复活