大型真菌菌种保藏技术规程

       大型真菌是菌物中的一个重要类群，很多种类具有较高的营养价值和药用价值，是目前菌物中最有开发应用前景的一类；此外，一些大型真菌能够分解枯死植物，对维持自然界物质循环、生态平衡有重要的作用，可开发应用于造纸业和环境净化；一些大型真菌能引起树木病害或损害多种木质产品，对此类病原真菌的认识的加强，有利于预防和减少危害的发生。大型真菌的规范性保藏对于微生物菌种资源的安全、高效保藏及共享具有重意义。

       制订科学、适用的大型真菌菌种保藏技术规程对长期有效保藏遗传资源、异地保藏生物多样性具有重要的价值和意义。

 

1 范围

本规程规定了大型真菌菌种保藏的基本原则、方法及技术要求。

本规程适用于各类大型真菌菌种的保藏。

2 术语与定义

2.1大型真菌  macrofungi

大型真菌是菌物中形成大型子实体的一类真菌，泛指广义上的蘑菇或蕈菌。

2.2程控降温 controlled rate freezing

2.3液氮超低温保藏  preservation in liquid nitrogen

液氮超低温保藏技术是将菌种在-196℃的液态氮，或在-150℃的气态氮中长期保藏的方法，其原理是利用生物在-130℃以下新陈代谢趋于停止而有效地保藏微生物。

3 原理

菌种保藏的原理是通过低温、干燥、隔绝空气和断绝营养等手段，以达到最大限度地降低菌种的代谢强度，抑制菌丝的生长和繁殖，使其生命活动降低到极低的程度或处于休眠状态，从而延长菌种的保藏时间。

4技术要求

4.1 不同菌种应根据要求选择适合的培养基进行培养。

4.2 接种须无菌操作，避免杂菌污染。

4.3 定期检查

保藏期间要定期检查保藏菌种的冰箱温度和湿度；检查保藏器皿的棉塞有无生霉现象，如发现异常则立即取出该管重新纯化，经培养后补上空缺；在低倍解剖镜下抽样检查有无螨虫等害虫，发现时须及时消除。

5 方法与步骤

5.1 斜面低温保藏法

将要保藏的菌种接种在斜面培养基上，20℃－30℃培养，当菌丝长满斜面时取出，置于 4℃冰箱或冰柜中保藏，每隔 3-6 个月转接 1 次，具体间隔时间应根据菌种特性确定。

5.1.1 保藏设备和材料

4℃冰箱、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、三角瓶、接种针、试管、培养皿、漏斗、烧杯、吸管、琼脂粉等等。

5.1.2 斜面的制备

5.1.2.1 器皿的准备

在斜面制备的过程中要用到的一些玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、漏斗等，使用前洗净，并于80℃烘干备用。

5.1.2.2 培养基的制备

在烧杯中倒入500ml水，按配方称取材料，依次加入水中，逐个溶解，最后定容至1L(在加料过程中，先加缓冲化合物，然后是主要元素、微量元素，最后加维生素等)。冷却至室温，调pH值。然后将琼脂粉加入煮沸的液体培养基中，不断搅拌至融化为止，最后补足蒸发的水分。

5.1.2.3 分装

将配好的固体培养基趁热进行分装，装入试管中的培养基不宜超过试管高度的四分之一。在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口，以免弄湿棉塞造成污染。

5.1.2.4 灭菌与摆放斜面

将包扎好的培养基灭菌（0.1MPa,30min）。灭菌完毕后摆放斜面时，斜面长度不得超过试管管长的一半。

5.1.2.5 无菌检查

将制备好的斜面放入30℃培养箱中培养3天做无菌检查。

 

5.1.3 接种

在超净工作台上，用无菌接种针挑取菌丝体连同少量培养基，接种于适宜的无菌新鲜培养基斜面上，在管壁或小瓶外壁上分别贴好标签标明菌株编号（或名称），然后置于适宜温度的培养箱中培养。

5.1.4 培养

培养4-30天后，根据菌落的形态和其它培养特征，判断新培养物是否为原菌种，并注意有无杂菌污染现象。检查无误后，进行保藏。

5.1.5 低温保藏

培养好的斜面于 4℃－6℃保藏，相对湿度，通常在 50%－70%以下。

5.1.6 保藏时间

一般 3－6 个月。

5.1.7 菌种的转接

将斜面培养物转接到适宜的新鲜斜面上，在适宜的培养条件下进行培养。

5.1.8 菌种的复壮

如果发现菌种有退化现象，应将退化的菌种引入原来的生活环境中使其生长和繁殖，然后再进行纯种分离，例如在宿主体内生长等方法进行复壮。

5.1.9 斜面低温保藏法应注意事项

——每次转接时，应仔细核对各菌株的编号、所用培养基等，发现错误立即纠正。

——每次转接培养后，应对照原保藏的菌株和菌种顺序号卡片名录，检查其培养特征，核实无误后，再行存放。

——斜面低温保藏的菌种，一般每个菌株应保藏相继的三代培养物，以便对照。

5.2 液氮超低温保藏法

5.2.1 保藏设备和材料

液氮罐、程控降温仪、超净工作台、高压消毒器、菌种培养箱、酒精灯、培养皿、打孔器、安瓿管（圆底硼硅玻璃制品或螺旋口的塑料管），10%甘油或 5%或 10%的二甲基亚砜、马铃薯、葡萄糖、琼脂粉等。

5.2.2 安瓿管的清洗和消毒

安瓿管（2 ml）使用前先用自来水冲洗，再用蒸馏水漂洗，于80℃烘箱烘干。将标签放入安瓿管上部，灭菌(0.103MPa,30min)，备用。

5.2.3 保护剂的配制和灭菌

一 般 常 用 甘 油 或 二 甲 基 亚 砜 作 保 护 剂 。 将 甘 油 配 成 10% 的 溶 液 ， 灭 菌 (0.1MPa,30min)，备用；或二甲基亚砜配成5%或10%的溶液，过滤灭菌，备用。

5.2.4 菌种的准备

将菌种接种于马铃薯葡萄糖琼脂或综合马铃薯培养基平板上，20℃－28℃下培养，待菌丝长满后，用无菌打孔器从平板上切取大小均匀的小块（直径约 5-10mm），转入安瓿管中；或在安瓿管中加 1.2-2ml 的琼脂培养基，接种，培养 2-10 天。最后加 1.5ml保护剂，封口。

5.2.5 冻结

一般冷冻速度控制在以每分钟下降 1℃为好，使样品冻结到-35℃。

目前常用的有三种控温方法

——程控降温法：应用电子计算机程序控制降温装置，可以稳定连续降温，能很好地控制降温速率。

——分段降温法：将菌体在不同温级的冰箱或液氮罐口分段降温冷却，或悬挂于冰的气雾中逐渐降温。一般采用二步控温，先将安瓿管或塑料小管置于-20℃至-40℃冰箱中 1-2 小时，然后取出放入液氮罐中快速冷冻。这样冷冻速率大约每分钟下降 1-1.5℃。

——对耐低温的微生物、可以直接放入气态或液态氮中。

5.2.6 保藏

在气相中-150℃，液相中-196℃。

5.2.7 保藏时间

一般10年以上。

5.2.8 转接方法

从液氮罐中取出安瓿管，立即放入 38℃-40℃温水中，快速复苏。为了防止污染，用 75%酒精洗安瓿管表面，待表面干燥后，用已消毒过的剪刀在安瓿管一端敲开或开启塑料小管，将内容物移至适宜的培养基上，并置于适宜温度的培养箱中进行培养。

5.2.9 液氮保藏应注意事项

——防止冻伤，操作注意安全，戴面罩及皮手套；

——安瓿管要用圆底的。若用塑料管一定要拧紧管盖；

——运送液氮时一定要用专用特制的容器，绝不可用密闭容器存放或运输液氮，切勿使用保温瓶存放液氮；

——注意存放液氮容器的室内通风，防止过量氮气使人窒息；

——当从液氮容器取出安瓿管时，要特别小心，防止破裂爆炸；

——注意观察液氮容器中液氮的残存量，定期填充液氮。