工业微生物育种的基本原理（2）

一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变，包括一对或少数几对碱基的缺失、插入或置换，而导致的遗传变化称为基因突变，其发生变化的范围很小，所以又称点突变或狭义的突变。染色体畸变是指大段染色体的缺失、重复、倒位、易位。广义的突变包括染色体畸变和点突变。从自然界分离得到的菌株一般称野生型菌株，简称野生型。野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，称突变株。

 

基因突变的类型极为多样。人们可从不同的角度对基因突变进行分类，并给以不同的名称。根据突变体表型不同，可把突变分成以下几种类型：

 

1.营养缺陷型：某一野生型菌株因发生基因突变而丧失合成一种或几种生长因子、碱基或氨基酸的能力，因而无法在基本培养基（MM）上正常生长繁殖的变异类型，称为营养缺陷型，它们可在加有相应营养物质的基本培养基平板上选出。营养缺陷型突变株在遗传学、分子生物学、遗传工程和育种等工作中十分有用。

 

2.抗性突变型：抗性突变型是指野生型菌株因发生基因突变，而产生的对某化学药物或致死物理因子的抗性变异类型，它们可在加有相应药物或用相应物理因子处理的培养基平板上选出。抗性突变型普遍存在，例如对一些抗生素具抗药性的菌株等。抗性突变型菌株在遗传学、分子生物学、遗传育种和遗传工程等研究中极其重要。

 

3.条件致死突变型：某菌株或病毒经基因突变后，在某种条件下可正常地生长、繁殖并呈现其固有的表型，而在另一种条件下却无法生长、繁殖，这种突变类型称为条件致死突变型。广泛应用的一类是温度敏感突变型。这些突变型在一定温度条件下并不致死，所以可以在这一温度中保存下来。它们在另一温度下是致死的，通过它们的致死作用，可以用来研究基因的作用等问题。

 

4.形态突变型：形态突变型是指由突变引起的个体或菌落形态的变异，一般属非选择性突变。例如，细菌的鞭毛或荚膜的有无，霉菌或放线菌的孢子有无或颜色变化，菌落表面的光滑、粗糙以及噬菌斑的大小、清晰度等突变。

 

5.抗原突变型：抗原突变型是指由于基因突变引起的细胞抗原结构发生的变异类型，包括细胞壁缺陷变异（L型细菌等）、荚膜或鞭毛成分变异等，一般也属非选择性突变。

 

6.其他突变型：如毒力、糖发酵能力、代谢产物的种类和产量以及对某种药物的依赖性等的突变型。

 

某一细胞（或病毒颗粒）在每一世代中发生某一性状突变的概率，称突变率。例如，突变率为10^-8者，即表示该细胞在1亿次分裂过程中，平均会发生1次突变。为方便起见，突变率也可以用某一单位群体在每一世代（即分裂一次）中产生突变株的数目来表示。例如，一个含10⁸个细胞的群体，当其分裂为2×10⁸个细胞时，即平均发生1次突变的突变率也是10^-8。某一基因的突变一般是独立发生的，它的突变率不会影响其他基因的突变率。这表明要在同一细胞中同时发生两个或两个以上基因突变的概率是极低的，因为双重或多重基因突变的概率是各个基因突变概率的乘积，例如某一基因的突变率为10^-8，另一为10^-6，则双重突变的概率仅10^-14。

 

基因突变一般有以下7个共同特点：

 

1.不对应性：即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。例如，细菌在有青霉素的环境下，出现了抗青霉素的突变体；在紫外线的作用下，出现了抗紫外线的突变体；在较高的培养温度下，出现了耐高温的突变体等。从表面上看，会认为正是由于青霉素、紫外线或高温的“诱变”，才产生了相对应的突变性状。事实恰恰相反，这类性状都可通过自发的或其他任何诱变因子诱发得到。这里的青霉素、紫外线或高温仅是起着淘汰原有非突变型(敏感型)个体的作用。

2.自发性：由于自然界环境因素的影响和微生物内在的生理生化特点，在没有人为诱发因素的情况下，各种遗传性状的改变可以自发地产生。

3.稀有性：指自发突变的频率较低，而且稳定，一般在10-6～10-9 间。

4.独立性：突变的发生一般是独立的，即在某一群体中，既可发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或任何其他药物的抗药性。某一基因的突变，即不提高也不降低其他任何基因的突变率。突变不仅对某一细胞是随机的，且对某一基因也是随机的。

5.可诱变性：通过各种物理、化学诱变剂的作用，可提高突变率，一般可提高10～105倍。

6.稳定性：由于突变的根源是遗传物质结构上发生了稳定的变化，所以产生的新性状也是稳定的和可遗传的。

7.可逆性：由原始的野生型基因变异为突变型基因的过程称为正向突变，相反的过程则称为回复突变。实验证明，何性状既有可能正向突变，也有可能发生回复突变，两者发生的频率基本相同。

 

在各种基因突变中，抗性突变最为常见。但在过去很长一段时间中对这种抗性产生的原因争论十分激烈。一种观点认为，突变是通过适应而发生的，即各种抗性是由其环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的，突变的原因和突变的性状间是相对应的，并认为这就是“定向变异”。另一种看法则认为，基因突变是自发的，且与环境是不相对应的。从1943年起，经过几个严密而巧妙的实验设计，终于解决了这场纷争。

 

1．变量试验  又称波动试验或彷徨试验。1943年Luria和Delbruck根据统计学的原理，设计了如下实验。实验要点是：取敏感于噬菌体T1的大肠杆菌对数期肉汤培养物，用新鲜培养液稀释成浓度为10³／m1的细菌悬液，然后在甲、乙两试管内各装10m1。接着把甲管中的菌液先分装在50支小试管中(每管装0.2m1)，保温24—36小时后，即把各支小管的菌液分别倒在50个预先涂有T1的平板上，经培养后分别计算各皿上所产生的抗噬菌体的菌落数；乙管中的10ml菌液不经分装先整管保温24—36小时，然后才分成50份加到同样涂有Tl的平板上，经适当培养后，同样分别计算各皿上产生的抗性菌落数。结果发现，来自甲管的50皿中，各皿间抗性菌落数相差极大，而来自乙管的则各皿数目基本相同。这就说明大肠杆菌抗噬菌体性状的突变，不是由所抗的环境因素——噬菌体诱导出来的，而是在它接触到噬菌体前，在某一次细胞分裂过程中随机地自发产生的。这一自发突变发生得越早，则抗性菌落出现得越多，反之则越少。噬菌体这里仅起着淘汰原始的未突变的敏感菌和甄别抗噬菌体突变型的作用。利用这一方法，还可计算出突变率。

 

2．涂布试验   1949年，Newcombe设计了一种与变量试验相似，方法更为简便的证实同一观点的实验，这就是涂布试验。与变量试验不同，他用的是固体平板培养法。先在12只培养皿平板上各涂以数目相等(5×10⁴)的敏感于噬菌体Tl的大肠杆菌细胞，经过5小时的培养，它们约繁殖了12.3代，于是在平板上长出大量的微菌落(这时每个菌落约含5100个细菌)。取其中的6皿直接喷上Tl噬菌体，另6皿则先用灭菌玻棒把平板的微菌落重新均匀涂布一遍，然后同样喷上相应的T1。经培养过夜后，计算这两组培养皿板上所形成的抗噬菌体菌落数。结果发现，在涂布过的一组中。共长出抗性菌落353个，要比未经涂布过的(仅28个菌落)高得多。这也意味着该抗性突变发生在未接触噬菌体之前。噬菌体的加入只起甄别这类自发突变是否发生的作用，而根本不是诱导突变的因素。

 

3．平板影印培养试验  1952年Lederberg夫妇证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。所谓平板影印培养法，实质是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法。其基本过程是：把长有许多菌落(可多达数百个)的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱上，使其上沾满来自培养皿平板上的菌落。然后可把这一“印章”的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后，对各平板相同位置上菌落作对比后，就可选出适当的突变型菌株。

 

基因突变的原因是多种多样的，它可以是自发的或诱发的。诱发的又可分为点突变和染色体畸变，它们还可进一步细分，具体如下。

 

诱发突变简称诱变，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。凡具有诱变效应的任何因素，都可称为诱变剂。

 

（1）碱基的置换：碱基置换可分为两类：一类叫转换，即DNA链中的一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所置换；另一类叫颠换，即一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所置换。

①直接引起置换的诱变剂：这是一类可直接与核酸的碱基发生化学反应的诱变剂，在体内或离体条件下均有作用，例如亚硝酸、羟胺和各种烷化剂等，后者包括硫酸二乙酯（DES）、甲基磺酸乙酯（EMS）、N-甲基-N′-硝基-N -亚硝基胍（NTG）、乙烯亚胺、环氧乙酸、氮芥等。亚硝酸(HNO₂)的作用机制主要是脱去碱基上的氨基，如A,C,G分别脱去氨基而成为H(次黄嘌呤),U(尿嘧啶)、X(黄嘌呤)等，复制时它们分别与C,A,C配对。原理是H(次黄嘌呤)有两种异构体，一种是酮式，另一种是烯醇式，它们可分别与T及C配对结合，可以引起碱基对的转换而造成突变，而且，AT→GC，GC→AT的转换已经得到证实。由于X的分子结构只能与C配对，而不能与T配对，所以，它不能引起GC→AT的碱基对转换而造成突变。

②间接引起置换的诱变剂：它们都是一些碱基类似物，如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氨基尿嘧啶(5-AU)、8-氮鸟嘌呤(8-NG)、2-氨基嘌呤(2-AP)和6-氯嘌呤(6-CP)等，5-溴尿嘧啶（5-bromouracil,5-BU）它和T很相似，仅在第5个碳原子上由溴（Br）取代了T的甲基。5-BU有两种异构体，一种是酮式，另一种是烯醇式，它们可分别与A及G配对结合，这样在DNA复制中一旦掺入5-BU就会引起碱基的转换而产生突变。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而与A配对。5-BU很容易进行酮式与烯醇式结构的互变异构，当DNA复制时，烯醇式5-BU不与A而与G配对，从而造成AT→GC的转换。其作用是通过活细胞的代谢活动掺入到DNA分子中而引起的，故是间接的。

 

（2）移码突变：指诱变剂会使DNA序列中一个或少数几个核苷酸发生增添(插入)或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码发生转录和翻译错误的一类突变。由移码突变所产生的突变株，称为移码突变株。与染色体畸变相比，移码突变只能算是DNA分子的微小损伤。能引起移码突变的因素是一些吖啶类染料，包括原黄素、吖啶黄、吖啶橙和α-氨基吖啶等。目前认为吖啶类化合物引起移码突变的机制是因为它们都是一种平面型三环分子，结构与一个嘌呤-嘧啶对十分相似，故能嵌入两个相邻DNA碱基对之间，造成双螺旋的部分解开(两个碱基对原来相距0.34nm，当嵌入一个吖啶分子后，即变成0.68 nm，从而在DNA复制过程中，使链上增添或缺失一个碱基，并引起了移码突变。

 

（3）染色体畸变：某些强烈理化因子，如X射线等的辐射及烷化剂、亚硝酸等，除了能引起上述的点突变外，还会引起DNA的大损伤——染色体畸变，既包括染色体结构上的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。染色体畸变在高等生物中很容易观察。在微生物中，尤其在原核生物中，近年来才证实了它的存在。许多理化诱变剂的诱变作用都不是单一功能的。例如，亚硝酸既能引起碱基的转换作用，又能诱发染色体畸变。

 

自发突变是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。随诱变机制的研究，对自发突变的原因已有所认识，下面讨论几种自发突变的可能机制。

 

(1) 背景辐射和环境因素的诱变  不少“自发突变”实质上是由一些原因不详的低剂量诱变因素长期的综合效应导致。例如充满宇宙空间的各种短波辐射、高温的诱变效应以及自然界中普遍存在的一些低浓度的诱变物质的作用等。

 

(2) 微生物自身有害代谢产物的诱变  过氧化氢是普遍存在于微生物体内的一种代谢产物，它对脉孢菌具有诱变作用。这种作用可因同时加入过氧化氢酶而降低，如果同时再加入过氧化氢酶抑制剂，则又可提高突变率。这就说明，过氧化氢可能是自发突变中的一种内源诱变剂。在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株，可能也是同样的原因。

 

(3)由DNA复制过程中碱基配对错误引起  据统计，DNA链每次复制中，每个碱基对错误配对的频率是10-7～10-11，而一个基因平均约含1000 bp，故自发突变频率约为10-6。因此，若对细菌做一般液体培养时，因其细胞浓度常可达到108个/ml，故经常会在其中产生自发突变株。

 

 

（1）紫外线诱变机理：在育种实践中应用最方便最广泛的物理诱变因素是紫外线。这种光线的波长稍短于可见光中的紫光，波长范围从136-390nm。它是一种非电离辐射，能使被照射物质分子或原子中内层电子提高能级，但并不获得或失去电子，所以不产生电离。紫外线诱变的最佳波长范围是200-300nm，其中又以260nm左右最佳。紫外线的生物学效应主要在于它可引起DNA的变化。DNA强烈吸收紫外线，尤其是DNA链上的碱基对。对紫外线嘧啶比嘌呤敏感得多，几乎要敏感100倍。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链断裂、DNA分子内和分子间的交联、核酸与蛋自质的交联，胞嘧啶和尿嘧啶的水合作用以及嘧啶二聚体的形成，特别是后者。当DNA复制时，双链须先变成单链，然后各自再与附近的碱基形成互补链，两链之间嘧啶二聚体的交联会阻碍双链的分开和复制。同侧链上相邻胸腺嘧啶二聚体的形成，会阻碍碱基的正常配对。在正常情况下，胸腺嘧啶应与腺嘌呤配对，但两个相邻胸腺嘧啶的连接就可能改变这种情况，足以破坏腺嘌呤的正常掺入。复制会在这一点上突然停止或错误的进行。如新生成的DNA单链改变了的碱基顺序，则在随后的复制过成中，已改变的DNA链仍以自身为模板进行复制，进而产生了一个在两条链上碱基顺序都有错误的分子，其后果是基因突变。

 

A、光复活作用：把经UV照射后的微生物立即暴露于可见光下时，就可出现其死亡率明显降低的现象，此即光复活作用。现已了解，经UV照射后带有嘧啶二聚体的DNA分子，在黑暗下会被一种光激活酶——光解酶（光裂合酶）结合，这种复合物在300～500 nm可见光下时，此酶会因获得光能而激活，并使二聚体重新分解成单体。与此同时，光解酶也从复合物中释放出来，以便重新执行功能。由于一般的微生物中都存在着光复活作用，所以在利用UV进行诱变育种等工作时，就应在红光下进行照射和后续操作，并放置在黑暗条件下培养。

 

B、切除修复：是活细胞内对被UV等诱变剂损伤后DNA的修复方式之一，又称为暗修复，这是一种不依赖可见光，只通过酶切作用去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常DNA链的核酸修复方式。在整个修复过程中，共有4种酶参与：①内切核酸酶在胸腺嘧啶二聚体的5′-P侧切开一个3′- OH和5′-P的单链缺口；②外切核酸酶从5′-P至3′-OH方向切除二聚体，并扩大缺口；③DNA聚合酶以DNA的另一条互补链为模板，从原有链上暴露的3′-OH端起逐个延长，重新合成一条缺失的DNA链；④通过连接酶的作用，把新合成的寡核苷酸的3′-OH末端与原链的5′-P末端相连接，从而完成了修复作用。

 

C、重组修复作用：又称为复制后修复，必须在DNA进行复制的情况下进行。重组修复可以在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下，以带有二聚体的这一单链为模板而合成互补单链，可是在每一个二聚体附近留下一个空隙。一般认为通过染色体交换，空隙部位就不再面对着胸腺嘧啶二聚体而面对着正常的单链，在这种情况下DNA多聚酶和连接酶便能起作用而把空隙部分进行修复。

 

D、紧急呼救（SOS）修复系统：这是细胞经诱导产生的一种修复系统。它的修复功能依赖于某些蛋白质的诱导合成，但这些蛋白质是不稳定的。SOS修复功能和细菌的一系列生理活动有关，如细胞的分裂抑制、引起DNA损伤的因素和抑制DNA复制的许多因素都能引起SOS反应。