微生物工业菌种的扩大培养

 

实验室种子的制备一般采用两种方式：固体孢子培养法和液体种子培养法。对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子，孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作简便，不易污染杂菌；对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用液体培养法。  

 

１、孢子的制备

（1）细菌的制备

细菌的斜面培养基多采用碳源限量而氮源丰富的配方，培养温度一般为37˚C。细菌菌体培养时间一般为1~2天，产芽孢的细菌培养则需要5~10天。

（2）霉菌孢子的制备

霉菌孢子的培养一般以大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等天然农产品为培养基，培养的温度一般为25~28˚C，培养时间一般为4~14天。

（3）放线菌孢子的制备

放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨和一些无机盐等，培养温度一般为28˚C，培养时间为5~14天。

 

２、液体种子制备

（1）好氧培养：

    对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。试管→三角瓶→摇床→种子罐 。

（2）厌氧培养：对于酵母菌，试管→三角瓶→卡式罐→种子罐 。

 

实验室制备的孢子或液体种子移种至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因不同菌种而异，但其原则为采用易被菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝）体在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。

 

 

1、种子罐的作用

主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝）体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的菌体量，以利于产物的合成。

 

种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。种子罐的级数取决于菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度、所采用发酵罐的容积等。对于细菌来说，菌体生长快，种子用量比例少，级数也较少，一般采用二级发酵，即茄子瓶→种子罐→发酵罐。对于霉菌来说，霉菌生长较慢，如青霉菌，需要三级发酵，即孢子悬浮液→一级种子罐（27˚C,40小时孢子发芽，产生菌丝）→二级种子罐（27˚C,10~24小时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐。对于放线菌来说，放线菌生长更慢，采用四级发酵。对于酵母菌来说，酵母生长比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一级种子。 

 

确定种子罐级数需注意一些问题。种子级数越少越好，可简化工艺和控制，减少染菌机会。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长，降低发酵罐的生产率，增加染菌机会。虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定。但也与所选用工艺条件有关。如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。 

 

（一）、影响孢子质量的因素及控制

 

生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材料质量波动。例如在四环素、土霉素生产中，配制产孢子斜面培养基用的麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢子质量的影响也不同。原材料质量的波动，起它要作用的是其中无机离子含量不同，如微量元素Mg²⁺  、Cu²⁺  、Ba²⁺ 能刺激孢子的形成。磷含量太多或太少也会影响孢子的质量。水质对孢子的质量也有影响，地区不同、季节变化和水源污染，均可造成水质波动，影响种子质量。

 

 

    温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。一般各生产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。

    制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量和质量有较大的影响。

 

一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢子，因为衰老的孢子已在逐步进入发芽阶段，核物质趋于分化状态。过于衰老的孢子会导致生产能力的下降。控制措施是孢子培养的时间应该控制在孢子量多、孢子成熟、发酵产量正常的阶段终止培养。

斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培养4天左右即于4˚C冰箱保存，发现冷藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以后冷藏，20天未发现自溶。

冷藏时间对孢子的生产能力也有影响。例如在链霉素生产中，斜面孢子在6˚ C冷藏两个月后的发酵单位比冷藏一个月降低18%，冷藏3个月后降低35%。

 

 

    培养基的营养成分要适合种子培养的需要，选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基；营养上要易于被菌体直接吸收和利用；营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要高，营养成分要尽可能与发酵培养基相近。

 

（1）温度

（2）通气量

   在种子罐中培养的种子除保证供给易被利用的培养基外，有足够的通气量可以提高种子质量。

 

种龄是指种子罐中培养的菌丝体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。通常种龄是以处于生命力极旺盛的对数生长期，菌体量还未达到最大值时的培养时间较为合适。时间太长，菌种趋于老化，生产能力下降，菌体自溶；种龄太短，造成发酵前期生长缓慢。不同菌种或同一菌种工艺条件不同，种龄是不一样的，一般需经过多种实验来确定。

 

接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。接种量的大小决定于生产菌种在发酵罐中生长繁殖的速度，采用较大的接种量可以缩短发酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时间，使产物的形成提前到来，并可减少杂菌的生长机会。但接种量过大或者过小，均会影响发酵。过大会引起溶氧不足，影响产物合成；而且会过多移入代谢废物，也不经济；过小会延长培养时间，降低发酵罐的生产率。

 

包括菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（色素、颗粒等。单细胞要求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐，有的还要求有一定的排列或形态；霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和内含物情况好。

 

包括种子液的糖、氮、磷的含量和pH变化、产物生成量、酶活力。

在抗生素发酵中，产物生成量是考察种子质量的重要指标，因为种子液中产物生成量的多少间接反映种子的生产能力和成熟程度。种子液中某种酶的活力，与目的产物的产量有一定的关联。