支原体培养基

[用途]

分离支原体

[配法]

牛心（去脂绞碎）250g ，氯化钠5g，胰蛋白酶（不含乳糖）2.5g，蛋白胨10g ，酵母浸膏1g ，琼脂粉14g ，蒸馏水1L。

（1）    牛心消化液配制：取去脂绞碎牛心250g ，氯化钠5g及蒸馏水900ml混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g / L 氯化钠溶液中，然后与上述牛心消化液混合，放置50-60 ℃ 水温箱内消化2h ，中间不断搅拌消化后用两层纱布过滤，滤液煮沸5min ，用滤纸过滤后，补足水分至原量，然后加酵母浸膏1g ，混匀，冷却后调pH 至8.0 ，分装后121 ℃ 灭菌15min 备用。

（2）    支原体基础琼脂：取上述牛心消化液（已加氯化钠）1L，加蛋白胨10g 和琼脂粉14g ，混合后，加热溶解调pH 至7.8-8.0，再加热煮沸，用脱脂棉或绒布过滤，过滤后分装于圆瓶中，每瓶70ml，121 ℃ 灭菌15min 备用

（3）    250g / L 鲜酵母液制备：食用鲜酵母块250g ，加蒸馏水1L ，混合后，煮沸2min ，用滤纸过滤，滤后置4 ℃ 冰箱中过夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g / L 氢氧化钠溶液调pH 至8.0，再煮沸1 次，冷却后，3000r／min 离心45min ，吸取上清液，分装于瓶中，121 ℃ 灭菌15min ，放4 ℃ 冰箱中备用，可保存3 月。

（4）    倾注平板：溶解基础琼脂，冷却至80 ℃ 左右，每瓶（70ml）内立即加预温在37℃ 培养箱内的无菌马血清或小牛血清20ml , 250g / L 鲜酵母浸出液10ml，10g / L 乙酸铊溶液2.5ml ，青霉素G 钾盐溶液（20 万U / ml )0.5ml 和两性霉素B 溶液（5mg／ml）0.1ml；充分混匀后倾注9cm平板，经37℃ 培养过夜，无菌试验阴性者，存放4 ℃ 冰箱备用

注：

(1)乙酸铊是极毒药品，须特别注意安全操作

(2)   支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长，肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落

(3)   支原体传代、移种用0.1 ％半固体琼脂，配制时除用0.1 ％琼脂粉外，其它成分与支原体基础培养基相同，但不加两性霉素，此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块，直接移种于半固体管中，置适当的气体环境中，培养3-5 天后，可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物，或呈颗粒状，即次代支原体

(4)   支原体传代用液体培养基：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加琼脂粉和两性霉素B 。

2 肺炎支原体分离用双相培养基

[用途]

用于喉拭标本直接分离肺炎支原体

[配法]

(1)底层琼脂斜面：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加两性霉素B 。无菌分装于经灭菌的链霉素空瓶中，每瓶3ml，置成斜面，此为底层

(2)   液体培养基：其成分与上述支原体传代用液体培养基相同。但在未高压灭菌前，再加入葡萄糖1g ，美蓝0.001g （即10g / L 美蓝溶液0.lml）, 1g / L 酚红溶液2ml , 115 ℃ 灭菌15min ，冷却后，再加入辅助成分和防止杂菌生长的成分。然后，在上述底层琼脂斜面上，每瓶再加入液体培养基3-5ml，瓶塞用煮沸灭菌的后口橡皮塞经37℃ 培养过夜，无菌试验阴性者，存放4 ℃ 冰箱中备用，可保存1 月

注：已接种的双相培养管，培养37℃ 普通环境2-4 周，观察结果，阳性生长见双相管由淡紫色变成绿色再转变为黄色，因肺炎支原体发酵葡萄糖，还原美蓝。取阳性管用分离支原体固体平皿分离菌落，平血放入含95 ％氮气和5 ％二氧化碳环境中，或放入含5%二氧化碳环境中培养2-4 周，阳性平皿可见菌落生长

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