菌种与种子扩大培养——微生物工业用菌种（2）

三、菌种保藏

    微生物工业生产与纯种培养、菌种质量密切相关，而菌种质量又与菌种的制备和保藏直接相关，所以说，菌种保藏是微生物工业生产的重要环节。菌种保藏的目的是保证菌种在长时间内尽可能保持原有菌株优良的生产性能，提高菌种的存活率，减少菌种的变异，以及不被杂菌污染以利于生产上长期使用。

    菌种保藏的基本原理是根据菌种的生理、生化特点，创造条件使菌种的代谢活动处于不活泼状态。在长期保藏菌种的实践中人们采用了多种方法，以适应不同的微生物。虽然不同的菌种的保藏方法各有优缺点，但其基本原则相同：选用优良纯种和创造一个最有利于菌种休眠的环境，即微生物生长繁殖和代谢受抑且不易突变的环境。这种环境要求干燥、低温、缺氧、缺营养、添加保护剂等。

下面介绍微生物工业菌种常用的保藏方法。

1 ．定期移植低温保藏法

    将菌种接到培养基斜面进行斜面培养或穿刺培养，也可进行液体培养，待长成健壮的菌体（对数期细胞、有性孢子、无性孢子等）后，置于4 ℃ 冰箱保存，间隔一定时间需要重新进行移植培养。例如，细菌通常1 个月移种一次，芽孢杆菌3 -6 个月移种一次，放线菌3 个月移种一次，酵母菌4-6 个月移种一次，丝状真菌4 个月移种一次。

    定期移植保藏法在工厂和实验室中普遍使用，具有简单易行、代价小，且可随时观察保藏菌种的死亡、变异、退化或染菌等优点，但因微生物在保藏期间仍有活动，所以存在保藏时间偏短、菌种易退化等不足。不过，酒精酵母经过数十年的移植没有发现变异或衰退现象。如果用灭菌的橡皮塞代替棉塞，则由于避免了水分的散失且隔绝氧气而能适当延长保藏期。采用石蜡液封菌体表面（液封面高出菌种表面1cm），同样能延长保藏期，这就是所谓的液体石蜡保藏法。

2 ．液氮超低温保藏法

    此法被公认为最有效和适用范围最广的菌种长期保藏技术之一，需要液氮罐或液氮冰箱、圆底安瓶管或塑料液氮保藏管。由于保藏采用低温-196～-150℃ ，必须按照“先慢后快”的原则进行操作。具体操作步骤如下：
( 1 ）将10%甘油或二甲亚砜作为保护剂分装于安瓿瓶中；

( 2 ）将长有菌落的琼脂悬浮于已灭菌的保护剂中；

( 3 ）熔封安瓿瓶口；

( 4 ）以1min下降1 ℃ 的速度降至-35 ℃ ，使瓶内悬浮液体冻结，然后将安瓶瓶置液氮冰箱中，于-130℃ 以下储藏；

( 5 ）恢复培养时，从液氮中取出安瓿瓶，立即于38-40 ℃ 水浴中摇动，至瓶内的冰全部融化，按常法进行培养。

3 ．甘油低温保藏法

    与液氮超低温保藏法类似，采用含10%-30%甘油的蒸馏水悬浮菌种，置于-80～-70 ℃ 温度下保藏，因此需要超低温冰箱。该法保藏期一般在1 年以上，特别适于基因工程菌株的保藏。

4．沙土保藏法

    此法适于芽孢杆菌、放线菌、曲霉菌等的保藏，保藏方法简单，主要过程如下：土壤（河沙需要10%-20% H Cl 溶液洗去有机质）经风干、过24 目筛、分装灭菌后，加入10 滴置备好的细胞或孢子悬液，然后在干燥器中吸干水分，再用火焰熔封管口，在室温或低温下可保藏数年。

5 ．麸皮保藏法

    麸皮保藏法又称为曲法保藏，常用于放线菌、霉菌等的保藏。将麸皮或其他谷物与培养基或水按一定比例（按菌种要求而定，一般质量比为1：1 ）拌匀，分装、灭菌后加入菌种培养，至长出菌丝，用干燥器干燥后在温度20 ℃ 条件下可长期保藏而不退化，故工厂经常采用。

6 ．蒸馏水保藏法

    此法是20世纪50年代开始采用的最简单的菌种保藏法，适用于酵母、真菌等。其原理是创造一个无营养的环境，在4-10 ℃ 下可较长时间保藏菌种。

7 ．冷冻干燥保藏法

    冷冻干燥保藏法是非常有效的菌种保藏法，采用干燥、低温、缺氧的条件保藏菌种，但需要冷冻干燥机等设备，操作复杂，菌种存活率的影响因素多，故其应用受限，主要在专业菌种保存单位采用。

四、菌种选育

    菌种选育就是按照生产的要求，以微生物遗传变异理论为依据，采用人工方法使菌种发生变异，再用各种筛选方法筛选出符合要求的目的菌种。菌种选育的目的包括改善菌种特性，以提高产量、改进质量、降低成本、改革工艺、方便管理及综合利用。选育菌种的基本方法包括自然选育、抗噬菌体选育、诱变育种、代谢控制育种、基因定向育种等一系列方法。

   诱变育种是采用物理、化学诱变因素使微生物DNA 上的碱基发生改变，而排列错误的D NA 模板形成异常的遗传信息，造成某些蛋白结构变异，导致细胞功能的改变。

代谢调控育种主要包括改变代谢通路的育种、改变自我代谢调节系统的育种。

基因定向育种主要是通过转化、转导、转染、杂交等手段有目的地增加、增强或取消、减弱某个或某些基因，从而得到需要的工程菌株。

有关育种的具体方法在微生物学中已有详细介绍，这里不再赘述。

五、防止菌种退化的措施

菌种退化是指整个菌体在多次接种传代过程中逐渐造成菌种发酵力（如糖、氮的消耗）或繁殖力（如孢子的产生）下降或发酵产物得率降低的现象。对此，首先要鉴定是否由于染菌引起产量下降或菌种生长延缓，可直接进行镜检判断或采用划线分离来确定是染菌还是菌种退化；其次要判断是否由于培养条件引起的暂时性变化，可通过培养几批菌种观察生长代谢情况来确定。

菌种退化的原因有两方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的要求没有得到满足，例如，遇到某些不利的条件，或失去某些需要的条件，或诱变型新菌株发生回复突变而丧失新的特性。

如果发现菌株已经发生退化，产量下降，则要进行分离复壮。因为在菌种发生衰退的时候，并不是所有的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境考验的、具有更强生命力的菌体。因此，采用单细胞菌株分离的措施，即用稀释平板法或平板划线法，以取得单细胞长成的菌落，再通过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来性状的菌株，甚至性状更好的菌株。对于某些菌种，还可配合其他办法分离单细胞菌株，如对芽孢杆菌，可先将菌液用沸水处理数分钟，再用平板进行分离，从所剩的孢子中挑选出最优的菌体来。

如果遇到某些菌株，即使进行单细胞分离仍不能达到复壮的效果，则可改变培养条件，以达到复壮的目的。例如，AT3.942 栖土曲霉的产孢子能力下降，可适当提高培养温度，恢复其能力。同时，通过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培养条件，能够得到产量较高的菌株。如果将单菌落分离和一定的培养条件相结合进行复壮，则更为有效。

此外，产生退化现象的原因多为基因突变，所以使用诱变剂处理，对退化类型的菌株具有杀伤力，则经诱变剂处理后再进行单菌落分离，就可得到复壮的菌株。同样道理，其他不具诱变作用的物理和化学因素也可用于复壮处理，但需针对具体菌种进行具体分析，以采用最佳的复壮方法。

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