菌种与种子扩大培养——种子扩大培养（1）

一、种子扩大培养的任务

现代发酵工业的生产规模越来越大，每只发酵罐的容积有几十立方米甚至几百立方米，要使小小的微生物在几十小时的较短时间内，完成如此巨大的发酵转化，必须具备数量巨大的微生物细胞。菌种扩大培养的目的就是为每次发酵罐的投料提供相当数量的、代谢旺盛的种子。因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间短。将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，有利于缩短发酵时间，提高发酵罐利用率，也有利于减少染菌的机会。因此，种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，而且要获得活力旺盛的、接种数量足够的培养物。对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度的快慢决定种子扩大培养的级数。例如，抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常用三级种子扩大培养，即将种子罐中的菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级发酵。一般50t 发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。三级发酵的流程如下：

斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→三级种子罐扩大培养→发酵罐

二、工业微生物的培养类型

工业微生物的培养方法分为静置培养和通气培养两大类型。

静置培养法是将培养基盛于发酵槽中，在接种菌种后，不通空气进行发酵，又称为嫌气性发酵。例如，酒精、丙酮、丁醇、乳酸等的发酵均属于此类型。

通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平，菌体才能迅速生长和发酵，又称为好气性发酵。例如，谷氨酸、核苷酸、有机酸和酶制剂等的发酵均属此类型。通气培养法又可分为液体培养与固态培养两大类型，其中每一类型又有表层与深层之分。例如，用作种子扩大培养的方法可分为：

( 1 ）液体培养法。可分为三角瓶摇床振荡式和回转式两种。摇瓶通气量的大小与摇床转数、三角瓶装液量比、液体特性等有关。例如，摇床转数越高，通气量越大，而三角瓶装液量比越小，即三角瓶容量越大、装液量越少的溶解氧水平越高。

( 2 ）表面培养法需克氏瓶、瓷盘等，菌体生长于培养基表面。

( 3 ）固态培养法需三角瓶、蘑菇瓶、克氏瓶、培养皿等装填固体培养基进行培养。

大规模工业生产常用的培养方法包括浅盘固体培养（如固体曲）、深层固体培养（机械通风制曲）、浅盘液体培养、深层液体通气培养、载体培养、两步法液体深层培养等。

1 ．固体培养

    固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称曲法培养，它来源于我国酿造生产特有的传统制曲技术。固体培养的最大特点是固体曲的酶活力高，但存在劳动强度大的缺点。目前，深层固体通风制曲可在曲房周围使用循环的、冷却增湿的无菌空气控制温度和湿度，并且能适应菌种在不同生理时期的需要灵活调节，曲层的翻动全盘自动化。

2 ．液体深层培养

浅盘液体培养法曾用于生产柠檬酸，但由于占地面积大，技术管理不便，随着柠檬酸发酵生产规模的扩大，浅盘液体培养很决为液体深层培养所代替。例如，青霉素发酵初期阶段曾采用玻璃瓶培养法，到了1946 年改用深层液体培养法大量生产。随后，液体曲、柠檬酸、谷氨酸、肌苷酸及其他发酵工业先后采用此法进行生产。液体深层培养的特点是容易按照生产菌种对代谢的营养需求以及不同生理时期对通气、搅拌、温度与培养基中氢离子浓度等的要求，选择最佳培养条件。因此，目前几乎所有好气性发酵都采取液体深层培养法。目前发酵罐的最大容积为500 ～1000t ，溶解氧、温度、pH 值等均由自控仪表控制。但是，液体深层培养容易感染杂菌，无菌操作要求高，在生产上防止杂菌污染是一个十分重要的问题。

3 ．载体培养

载体培养源于曲法培养，同时又吸收了液体培养的优点，是一种较新的培养方法。其特征是以天然或人工合成的多孔材料代替麸皮之类的固态基质作为微生物生长的载体，营养成分可以严格控制。发酵结束后只需将菌体和培养液挤压出来进行抽提，载体又可以重新使用。据报道，载体培养的霉菌、酵母、放线菌可以提取多种产物，如色素、肌苷酸、酶等。载体的取材必须经得起蒸汽加热或药物灭菌，具有多孔结构以保证足够的表面积，又能允许空气流通。对于其几何形状无特殊要求，形体大小应有适当范围。关于载体种类，目前以脲烷泡沫塑料块用得较多，石棉已很少采用。以泡沫塑料块为例，每块的平均质量1.5g, 边长5-20mm，吸水率（指载体体积与吸收的培养基体积之比）应保持较大的变化范围( 30%-90%），便于灵活掌握控制。

4．两步法液体深层培养

两步法液体深层培养在酶制剂生产和氨基酸生产方面应用较多。酶制剂生物合成的两步法液体深层培养，其每一步菌体相同而培养条件不同，因为微生物生长与产酶的最适条件往往有很大差异。例如，往培养基中添加葡萄糖能大大增加菌体或菌丝的生长，却严重阻碍许多酶的合成。加强培养液的通气虽能促进微生物生长，但在多数场合反而抑制酶的合成。为了取得最大量的活性酶，必须确定一种调节方法，既要求细胞的单位酶活性高，又要求细胞的数量多，也就是说，给菌种在各个生理时期创造不同的条件。两步法液体深层培养就是实现这种调节方法的具体措施之一，该法已在葡萄糖异构酶、α-甘露糖苷酶的微生物合成方面收到成效。酶制剂生产两步法的特点是将菌体生长条件（营养期）与产酶条件（自我繁殖期）区分开来，因而更容易控制各个生理时期的最适条件。菌种先在营养丰富的培养基上大量繁殖，然后收集菌体浓缩物，洗涤后转入添加诱导物的产酶培养基。在此期间，菌体积累了大量的酶，一般不再繁殖，营养成分或诱导物可得到充分利用。

    氨基酸生物合成的两步法液体深层培养，其每一步的菌种和培养基均不相同。第一步是有机酸发酵或氨基酸发酵，第二步是在微生物产生的某种酶作用下把第一步产物转化为所需的氨基酸。所以，这种氨基酸发酵生产方法又称为酶转化法。许多种氨基酸均可以通过两步法液体深层培养制得，但由于两步法工艺繁杂，目前谷氨酸、赖氨酸、丙氨酸等大多数是利用直接发酵生产。尽管如此，两步法液体深层培养仍有其实用价值，事实上有些氨基酸的生产还没能选育到适合直接发酵所需的菌种，而必须采用两步法生产。同时，这种方法对于研究微生物细胞内的酶系统和氨基酸的生物合成途径具有一定的作用和意义。

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