微生态活菌总论（上）

微生态活菌总论

微生态活菌制品系由人体正常菌群成员或具有促进正常菌群生长和活性作用的无害外籍细菌，经培养、收集菌体、干燥成菌粉后，加入适宜辅料混合制成。用于预防和治疗因菌群失调引起的相关症状和疾病。

微生态活菌制品必须由非致病的活菌组成，无论在生产过程、制品贮存和使用期间均应保持稳定的活菌状态。它可由一株、多株或几种细菌制成单价或多价联合制剂。根据其不同的使用途径和方法可制备成片剂、胶囊剂、颗粒剂或散剂等多种剂型。

基本要求

微生态活菌制品的制备方法、工艺应能保证成品含有足够的活菌数量，保持其稳定性，同时应防止外源因子的污染。

生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例”的有关要求。

制造

生产用菌种

生产用菌种应符合“生物制品生产检定用菌毒种管理规定”的有关规定。

1.       名称及来源

选用的生产用菌种应来自人体内正常菌群，或对人体无毒无害、具有促进正常菌群生长和活性作用的外籍细菌。细菌的分离过程和传代背景应清晰，应具备稳定的生物学和遗传学特性，并能保持稳定的活菌状态，经实验室和临床试验证明安全、有效。

2.       种子批的建立

菌种的属、种型分类鉴定，应依据最新版伯杰氏细菌系统鉴定手册（Bergry’s Manual of Systematic Bacteriology）和伯杰氏细菌命名手册（Bergry’s Manual of Determinative Bacteriology）的有关规定进行，包括形态、生长代谢特性检查。原始种子或主种子还应做遗传特性和抗生素敏感性等检查。

三级种子批常规检查包括以下3项：

（1）培养特性及染色镜检    将菌种接种于适宜培养基，置有氧或厌氧环境中培养，观察其生长情况，确定菌种为需氧性细菌或厌氧性细菌；以划线法观察在琼脂平皿上生长的单个菌落的形状、大小、表面、边缘、透明度、色泽等特征；也可观察菌种在不同温度、pH或不同浓度的氯化钠溶液等条件下的生长特性等。

取菌种的新鲜培养物涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的染色反应、形态、大小和排列等，有芽孢的细菌应同时观察芽孢的形状、大小和位置（也可增做芽孢染色）。检查结果均应符合原始菌种的特性。

（2）生化反应    按附录ⅪⅤ“细菌生化反应培养基”选择相应的培养基或其他适宜的方法进行，结果应符合原始菌种的特性。

（3）毒性试验    毒性试验是通过动物试验检查菌种是否存在不安全因素，以保证人体使用安全。

用体重18～22g小鼠5只，每只腹腔注射0.3ml新鲜菌液（不少于1.0×10⁹CFU/0.3ml）,连续观察3天，小鼠均应健康存活、体重增加；或每只小鼠经口灌胃0.5ml新鲜菌液（不少于1.0×10⁹CFU/0.5ml），每天1次，连续3天，从第1天灌胃起连续观察至第7天，小鼠均应健康存活、体重增加。

除另有规定外，原始种子或主种子批还需进行以下检查：

（1）细菌代谢产物——脂肪酸测定    照气相色谱法（附录Ⅲ Ｃ）或其他适宜的方法进行，应符合该菌种的特性。

（2）遗传特性分析    可采用细菌DNA的G+Cmol%的含量测定或其他适宜方法进行，应符合该菌种的遗传特性。

（3）抗生素敏感性试验   采用琼脂扩散纸片法或其他适宜方法进行菌株的抗生素敏感性检查，应符合该菌种的特性。

（4）稳定性试验    菌种在适宜培养基中，连续传代30代次后，将第30代培养物作种子批检定，全部检查结果应与原始菌种的特性一致。

4.种子批的保存

原始种子和主种子应冻干保存于8℃以下，工作种子应置于适宜温度保存。

菌粉制造

应包括种子液制备、大罐培养、收获菌体（或芽孢）和菌体干燥制成菌粉。如生产多价制品时，应每种菌分别培养，制备单价菌粉。

1.       生产用种子

启开工作种子批菌种，接种于适宜培养基进行多级种子扩增，应涂片做革兰氏染色，在显微镜下观察5～10个视野，细菌的染色反应、形态应一致并符合原始菌种的特征。制备过程应防止污染，菌种传代次数应符合规定。

2.    生产用培养基

采用经批准的培养基用于生产。

3.       培养

采用液体培养。将种子液置适宜条件下培养（包括厌氧或需氧、温度、时间等），培养过程中取样涂片做革兰氏染色镜检、pH值检测等，芽孢菌需进行芽孢形成率的检测，均应符合规定。培养结束后取样做纯菌检查，如发现污染应予废弃。

生产多价制品的单价菌粉时，应分别培养。

4.       收获菌体和制成菌粉

培养结束后离心收获湿菌体，与适宜的分散剂、稳定剂混合。采用真空冷冻干燥法干燥菌体，芽孢菌可采用加热干燥方法，再经粉碎、过筛制成粉末状菌粉。

5.       菌粉的保存及有效期

应通过活菌稳定性试验确定保存温度和有效期。

6.       菌粉检定

按“菌粉检定”项进行，符合规定后方可进行半成品配制。

半成品

1.       配制

同一工作种子批菌种生产的最多2批单价菌粉可按批准的比例与辅料混合均匀后制成半成品。配制多价制品时，应将各单价菌粉、辅料按配方比例和配制程序混合均匀，配制过程应防止污染。

2.       半成品检定

按“半成品检定”项进行，应符合规定。

成品

1.       剂型制备

根据制品的用途、使用对象和用药途径等因素确定剂型。制备过程应符合附录Ⅰ“制剂通则”项下相关剂型的规定。

2.    分批

成品批号应在半成品配制后确定，配制日期即为生产日期。同一批号的制品，应来源一致、质量均一，按规定要求抽样检验后，能对整批制品作出评定。应根据验证结果，规定半成品的分装时间，如超过24小时，应分为不同的亚批。

3.       分装、规格和包装

制品的分装应符合附录Ⅰ“制剂通则”的有关规定。包装应符合“生物制品包装规程”的有关规定。规格应符合批准的规格要求。

检定

微生态活菌制品质量检定应包括菌粉检定、半成品检定和成品检定。

菌粉检定

1.外观

应为白色、灰白色或灰黄色粉末。

2.目的菌检查

取少量菌粉加入适量，灭菌生理氯化钠溶液或其他适宜稀释液后，涂布在适宜琼脂平皿上，在适宜条件下培养，其培养物的生长特性和染色镜检的特征应符合生产用菌种特征。

3.杂菌检查

方法和结果判断见本总论附录3。如不符合规定应废弃。

4.干燥失重

菌粉中残余水分的含量会直接影响活菌的生存，须进行菌粉干燥失重的检查。应按附录Ⅶ Ｌ或仪器方法测定。

5.活菌数测定

测定每克菌粉中含有的活菌数量。方法见本总论附录2。

半成品检定

半成品须做杂菌检查，根据用药途径确定杂菌检查的质控指标。方法和结果判断见本总论附录3。

成品检定

1.       鉴别试验

检查成品中所含的目的菌是否符合生产用菌种的特性。即按上述“种子批的检定”方法进行生长特性、染色镜检和生化反应检查，应符合规定。对于多价制品，则须逐一检查单价菌特性。

2.        理化检查

（1）       外观  根据剂型，观察制品的外观、色泽。

片剂外观应完整、光洁，呈白色或类白色，间有菌粉色斑；颗粒剂、散剂和胶囊剂内粉末的粒子大小、色泽应均匀，间有菌粉色斑。

（2）干燥失重  按附录Ⅶ Ｌ或仪器方法测定，减失重量应不得超过5.0%，芽孢菌制品应不得超过7.0%。

（3）粒度  散剂和颗粒剂应进行粒度检查。

     按附录ⅤＧ第二法，采用单筛分法或双筛分法检查，应符合规定。

（4）装量（重量）差异  各剂型按附录Ⅰ“制剂通则”的相应规定进行，应符合规定。

（5）崩解时限  胶囊剂、片剂按附录ⅤＣ进行，应符合规定。

3.活菌数测定

按本总论附录2方法测定每克制品中的活菌数，应符合规定。多价制品应分别测定各单价活菌数。

4.杂菌检查

目的是检查成品中外源微生物的污染情况，以保证人体使用安全。

方法和结果判断与半成品的“杂菌检查”项相同。

5.安全试验

安全试验是通过动物试验进行的非特异性毒性检查，应根据制品的使用途径和人用剂量确定试验方法。

（1）肠道微生态活菌制品检查  称取2g制品，加入8ml生理氯化钠溶液中，混合均匀。用5只体重18～22g小鼠，每只小鼠经口灌胃0.5ml，每天1次，连续3天。自第1天灌胃起，连续观察7天，小鼠应健康存活、体重增加，判为合格。如不合格，可另选10只小鼠复试1次，判定标准同前。

（2）阴道微生态活菌制品检查  用24～26g雌性小鼠5只，，每只小鼠阴道内置入10mg制品，每天1次，连续3天。自给药第一天起，连续观察7天，小鼠应健康存活、体重增加，阴道局部无红肿、分泌物等症状，判为合格。

保存、运输及有效期