制备培养基的一般操作技术——消毒和灭菌

消毒和灭菌

消毒和灭菌两个名词在实际使用中常被混用，其实它们的含义是有所不同的。消毒是指应用消毒剂等方法以杀灭一切病原菌的繁殖体和芽孢而言（亦有认为仅指杀灭繁殖体者），而对非病原性细菌则不一定杀灭之；灭菌是指应用理化学方法杀灭切活菌和芽孢，使物体呈无菌状态而言。

1.物理方法

（1）干热灭菌法

① 火焚：凡无重复使用而又可焚毁的污染物体，均可用之。

② 火焰灭菌法：如接种环，镊尖，烙板等可在酒精灯或本生灯火焰中烧灼灭菌；试管口、吸管、培养瓶口等在接种操作时，可通过火焰进行灭菌。

3 干烤灭菌法：即使用干热灭菌箱进行干烤灭菌。一般加热至150-160 ℃ ，维持两小时，即可达到灭菌目的。主要用于空白玻璃器皿的灭菌。进行灭菌时，应有专人经常检查。以防温度过于升高（不得超过170 ℃ ），造成意外事故。如仅需烤干玻璃器皿时，加热至100℃即可。

( 2 )湿热灭菌法

① 煮沸：此法适用于注射器、刀、剪、镊等器械以及橡皮制品和软木塞等的消毒。一般细菌繁殖体经煮沸5分钟后即可杀灭。如加入1%碳酸氢钠，可增强杀菌效果，又可防止金属物品生锈。应使用冷蒸馏水以防水锈，水面须高出消毒物品至少2-3cm。如物品可疑沾污有细菌芽孢，可在水内加入石碳酸，使成5%溶液，并煮沸30分钟。但最好还是使用高压蒸汽灭菌。

② 流通蒸汽灭菌法：即使用阿诺氏灭菌器或普通蒸笼的流通蒸汽加热灭菌。其下部水锅应放入蒸馏水，每次用毕，如不继续使用，应将水排净，以防水锈。一般用于不能耐受高温的物质，如牛奶，明胶和含糖类的培养基等。其加热时间，应视消毒物品体积的大小而有所不同，自底锅水沸腾算起，一般经30分钟，可杀灭细菌繁殖体。

③ 间歇灭菌法：主要用于含血清鸡蛋等的培养基，即将培养基在血清凝固箱内放置成适当料面，每日加热75～85 ℃ ，30～60分钟，连续3 日，取出放入37 ℃ 恒温箱培养过夜。以检查灭菌效果。

④ 高压蒸汽灭菌法：即用高压蒸汽灭菌器进行灭菌、为培养基制备经常使用的灭菌方法，为了避免操作失误造成差错，影响工作，应依据不同型别的灭菌器特性、制订详细的操作规程，严格遵守进行灭菌。

在高压蒸汽灭菌器的使用中，最常发生的错误是未将蒸汽室中冷空气排除干净，造成已充分灭菌的假象。这是因为空气传热比蒸汽慢，热空气在同一温度下进行灭菌所需的时间可比蒸汽延长3-10 倍。实验证明，在同一压力下，因混有不同量空气。

( 3 )过滤除菌法

即使用各种特殊过滤滤器，将液体中细菌除去的方法。

① 常用的过滤器：有以下几种：

柏克非尔德（Berkefeled ）滤器：系由矽藻土制成，呈空心棒状并带有金属接头、带阴电。分为三型：V 型为粗号型，孔径在8-12μ之间，N 型为中号型，孔径在5-7μ之间；W 型为细号型，孔径在3-4μ之间。可按需要选用。V 型可供澄清和除去较大的细菌之用。N 型可除去一般细菌。W 型可除去所有细菌和较大的病毒。

钱勃兰滤器：系由无釉瓷和成，为一棒状整体，无金属接头，不易有漏洞。

蔡氏滤器：系以镀银的金属圆形夹持器将石棉滤板夹在中间作为过滤之用，滤板分K 型，普通EK 和特殊E K 三种型别。K 型孔大，供澄清液体用，后两型可供除菌用，滤板用过后即可弃去，使用方便，故前两种滤器现巳很少有人使用。

玻璃滤器：帆船牌玻擒滤器按其滤板孔径大小共分3 种，如表2-8 。

表2-8 玻璃过滤器的规格

新购的玻璃滤器在使用前应先用热盐酸或清洁液进行一次抽滤，随之以蒸馏水抽滤冲洗干净，使滤器中存在的灰尘杂质完全清除干净。每次用毕都须进行有效的洗涤处理。待别是6号除菌滤板，每次使用后应用有效洗涤液（化学纯浓硫酸5.72ml 、硝酸钠2.0和蒸馏水94ml、 充分混合均匀）进行一次抽滤，当抽至溶液尚未滤尽前，取下滤准浸入洗涤液中约48 小时，滤片两而均应接触溶液，取出后用热蒸馏水抽滤冲洗干净并烘干即可。

火棉胶滤膜：其制法系用火棉胶丙酮溶液以含戊醇不同量的乙醚混合液稀释制成。即于22.5℃ 恒温室中，倒入75ml混合液于一直径为20cm的浅玻璃盘内，自然蒸发1-3小时后，用蒸馏水充分冲洗即得。变更火棉胶用量与组成及蒸发状况、则可侧成平均孔径自3μ至10nμ 或更小的火棉胶膜。现已有各种规格的商售滤膜和配套的过滤装置供应，可按需要选购,因使用方便。已普遍采用。

② 过滤操作技术:由于液体仅藉重力作用不易通过滤器，因此，通常须用正压或负压进行过滤，但以减压最为方便。

过滤起始时，减压应小，然后逐步增大，一般以100-200mm Hg 为限。过滤时间不宜太久，防止螺旋体，弧菌等在屈曲运动时，借减压通过滤器。若排除弧菌、最好进行两次过滤。过高减压，滤液内的微细颗粒可堵塞滤孔以致失去过滤效能。过滤将近完毕时应立即停止抽气，否则滤液完全滤完时，可将原来不易通过的细菌也随之滤入。

A 、柏氏滤器的使用方法：装置前应先将滤器浸入水中并压入空气观察有无明显漏气现象。如有较大气泡逸出时，表明滤器不适使用。特别要注意滤棒和金属底座衔接处是否紧密。正常情况、滤器内外水应能通畅流通而无较大气泡发生。

灭菌前将玻筒、滤棒及橡皮塞等装接妥当，过滤瓶口及侧管口加上棉塞，然后分别以厚纸内衬纱布妥为包扎。于高压蒸汽锅中121℃灭菌15-20分钟。

进行过滤时，以无菌操作取出滤器，将橡皮塞装入过滤瓶口、严密塞好，并将其侧管连接于抽气机（l / 8-1／4 PS ）的橡皮管。再将待滤液倒入玻筒内，开始缓慢抽气保持滤液呈点滴状流入过滤瓶即可。滤毕，应先将抽气管夹紧，然后关闭抽气机，以防机油流入真空系统。待过滤瓶内负压恢复至常压后，以无菌操作将过滤液移入灭菌容器。

滤器于使用后，应立即浸泡于2%来苏溶液中至少半小时，取出，用毛刷在流水中洗刷干净。然后用2%氢氧化钠溶液通过滤器以除去蛋白质等有机物质，再用1MHCl通过滤器使其碱性中和，最后用蒸馏水进行过滤，迄至滤出水呈pH7.4为止。再使其干燥、以备下次使用。

B 、其他滤器装置比较简单，可按照产品说明书即可妥为安装。其使用原则大致与上述相似。蔡氏滤器用毕后、将滤器全部放水锅中煮沸半小时，弃去滤板，再在流水中洗净擦干即可。玻璃滤器用完后，应先用水由颈端反方向过滤冲洗，再浸泡于10%硝酸溶液或含有1%亚硝酸钠的1 M 硫酸溶液中过液，使有机物质完全氧化。直至玻璃砂滤板上无黑色存在。再用流水冲洗及蒸馏水过滤、待干后存放备用。

C 、过滤的滤液应立即吸取少许分别接种血琼脂料面和疱肉培养基各一管，置37 ℃ 恒温箱培养48小时，如无菌生长，方可应用。

③ 影响过滤的因素：一般认为过滤只不过是机械的过筛作用。即由于滤孔小，因而细菌不能通过，这种理解是不够全面的，现已知有些理化因素也能影响过滤作用，例如，在酸性时常能阻滞细菌和某些病毒通过，而在碱性时则较易通过；加温至25℃的悬液比冷悬液较易通过；稀薄液比粘碉液容易通过等。此外，抽气压力的高低也对过滤的效果具有明显影响。这些都应在进行过滤时加以考虑和注意。

2.化学方法

（1）石碳酸：为一种常用的防腐剂和杀菌剂，易溶于水和有机溶剂。有挥发性。其主要作用是使细菌蛋白质凝固。渗透性较强。1% 溶液能在数分钟内杀灭大多数病原菌。5%溶液能在24h杀死结核杆菌，杀灭细菌芽孢则需要更长时间。对金属无腐蚀作用，且不受有机物质的影响。一般消毒浸泡时间至少12 -24h 。加温可增进其杀菌效能，对机体细胞具有毒性，能通过皮肤迅速吸收。

5%溶液可烧灼皮肤，引起烧伤。配制溶液浓度不宜超过5%，如加入过多。则可有部分石碳酸不再溶解。石碳酸应保存于密封暗色玻璃瓶内以避免挥发。

（2）来苏儿：为甲酚与绿肥皂制成的棕色液体，一般含甲酚不应少于47%。其杀菌能力因含有皂液，具有脱脂和洗涤作用。有利于酚和细菌接触，故较石碳酸可强2-4 倍。但其杀菌作用则与石碳酸相似。一般常用量为l-3%溶液。

（3）氯化汞：又称升汞，为白色结晶粉末，毒性甚强，切勿入口且能腐蚀金属，能使蛋白质迅速凝固，故不宜用于含有蛋白质的物品，其0.2%溶液对细菌芽孢经1小时可以杀灭。0.1％溶液经数十分钟浸泡可杀死一般细菌繁殖体，亦可用于手的消毒，为便于识别，避免意外，常加有少许色索。

（4）碘酒：为碘、碘化钾和酒精的混合溶液，能氧化菌体蛋白质的活动基因，并与蛋白质的氨基结合而使之变性。其碘的浓度通常为2-7%，实验证明，其1: 2500稀溶液，于10分钟可杀死炭疽杆菌的繁殖体和芽孢。主要用于皮肤消毒，涂抹后待其干燥，再以70%酒精擦去，以免刺激皮肤。

（5）乙醇：俗称酒精，有脱水作用，可使菌体蛋白质凝周变性。50%浓度能在15分钟杀死细菌繁殖体，但对芽孢无效。故一般酒精可带有细菌芽孢，在使用时应予注意。通常使用其70%溶液作为皮肤及小型器械等的消毒。

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