微生物生长繁殖的控制

 在适宜条件下，对数生长期的微生物能以最大的比生长速率进行生长繁殖，产生大量的新个体，例如每个 E.coli 细胞的重量虽然大约只有 10 -12 g ，但是，如果一个 E.coli 在肉汤培养基和在适宜条件下，培养 48h 产生的新个体的总重量可超过地球重量的 4000 倍！实际上生长是微生物与环境相互作用的结果。在自然界电离辐射、太阳、温度、湿度、营养物质消耗和代谢产物积累等环境影响下， E.coli 不可能以最大比生长速率无限制地生长下去，再加上 E.coli 噬菌体作用，一些 E.coli 也会被裂解而死亡，使细菌数量不会无限增加。另一方面微生物中有不少是动物、植物和人类的病原菌，也必须对这类病原菌进行控制。因此，如何控制微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，在实际应用中具有重要的意义。

    有关的术语

    抑制 (inhibition) ：抑制是在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。

    死亡 (death) ：死亡是在致死剂量因子或在亚致死剂量因子长时间作用下，导致微生物生长能力不可逆丧失，即使这种因子移去后生长仍不能恢复的生物学现象。

    防腐 (antisepsis) ：防腐是在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制微生物生长的一种措施，它能防止食物腐败或防止其他物质霉变。例如日常生活中以干燥、低温、盐腌或糖渍等防腐方法是保藏食品 ( 物 ) 的主要方式。具有防腐作用的化学物质称为防腐别。

    消毒 (disinfection) ：消毒是利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微生物的一种措施，它可以起到肋止感染或传播的作用：具有消毒作用的化学物质称为消毒剂 (disinfectant) ，一般消毒剂在常用浓度下只能杀死微生物的营养体，对芽孢则无杀灭作用。

    灭菌 (sterilization) ：灭菌是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施。灭菌后的物体不再有可存活的微生物。

    化疗 (chemotherapy) ：化疗是指利用具有选择毒性的化学物质如磺胺、抗生素等对生物体内部被微生物感染的组织成病受细胞进行治疗，以杀死组织内的病原微生物或病变细胞，但对机体本身无毒害作用的治疗措施。

   理化因子对微生物生长是起抑菌作用还是杀菌作用并不是很严格分开的。因为理化因子的强度或浓度不同作用效果也不同，例如有些化学物质低浓度有抑菌作用，高浓度则起杀菌作用，就是同一浓度作用时间长短不同，效果也不一样；不同微生物对理化因子作用的敏感性不同，就是同一种微生物，所处的生长时期不同，对理化因子作用的敏感性也不同。

一、控制微生物的化学物质

1 ．抗微生物剂

    抗微生物剂 (antimicrobial agcnt) 是一类能够杀死微生物或抑制微生物生长的化学物质，这类物质可以是人工合成的，也可以是生物合成的天然产物。根据它们抗微生物的特性可分为：①抑菌剂，它们能抑制微生物生长，但不能杀死它们，作用机理是这类物质结合到核糖体上抑制蛋白质合成，导致生长停止，由于它们同核糖体结合不紧，它们在浓度降低时又会游离出来，核糖体合成蛋白质的能力恢复，使生长恢复； ②杀 菌剂，它们能杀死细胞．但不能使细胞裂解，由于它们是紧紧地结合到细胞的作用靶上，即使在浓度降低时也不能游离出来，因此生长不能恢复；③溶菌剂，它们能通过诱导细胞裂解的方式杀死细胞，将这类物质加到生长的细胞悬液里以后会导致细胞数量成细胞悬液的混浊度降低，能抑制细胞壁合成或损伤细胞质膜的抗生素就属于溶菌剂。

    抗微生物剂又称杀菌剂，通常又将它们分为消毒剂和防腐剂，前者通常用来杀死非生物材料上的微生物，后者具有杀死微失物或抑制微生物生长的能力，但对于动物或人体的组织无毒害作用。杀菌剂广泛用于热敏感的其他物质或用具，如温度计、带有透镜的仪路设备、聚乙烯管或导管等的灭菌；在食品、发酵工业，自来水厂等部门常用杀菌剂杀死墙壁、楼板与仪器设备等表面和自来水中的微生物；对于空气中的微生物则用甲醛、石炭酸 ( 酚 ) 、高锰酸钾等化学试剂进行薰、蒸、喷雾等方式杀死它们。表中列出了与健康有关的一些常用的消毒剂与防腐剂及其作用的机理。

常用的防腐剂和消毒剂

2 ．抗代谢物

    在微生物生长过程中常常需要一些生长因子才能正常生长，那么可以利用生长因子的结构类似物干扰机体的正常代谢，以达到抑制微生物生长的目的。例如磺胺类药物是叶酸组成部分对氨基苯甲酸的结构类似物，磺胺类药物被微生物吸收后取代对氨基苯甲酸，干扰叶酸的合成，抑制了转甲基反应，导致代谢的紊乱，从而抑制生长。同样，对氟苯丙氨酸、 5- 氟尿嘧啶和 5- 溴胸腺嘧啶，分别是苯丙氨酸、尿嘧啶和胸腺嘧啶的结构类似物，由这些结构类似物取代正常成分之后造成代谢紊乱，以抑制机体的生长。因此生长因子等的结构类似物又称为抗代谢物 (antimctabolite) ，它在治疗由病毒和微生物引起的疾病上起着重要作用。

3 ．抗生素

    抗生素 (antibiotic) 是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们是能抑制其他微生物生长或杀死它们的化合物，它们主要是通过抑制细菌细胞壁合成、破坏细胞质膜、作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、抑制蛋白质和核酸合成等方式来抑制微生物的生长或杀死它们。

    抗生素与其他一些抗代谢药物如磺胺类药物通常是临床上广泛使用的化学治疗剂，但多次重复使用，使一些微生物变得对它们不敏感，作用效果也越来越差。根据对某些抗生素不敏感的抗性菌株的研究表明，抗性菌株具有以下特点：①细胞质膜透性改变，如抗四环素的委内瑞拉链霉菌的细胞质膜透性改变，阻止四环素进入细胞； ② 药物作用靶改变，二氢叶酸合成酶是磺胺类药物作用的靶，抗磺胺药物的菌株改变了二氢叶酸合成酶基因的性质，合成了一种对磺胺药物不敏感的二氢叶酸合成酶；③合成了修饰抗生素的酶，这些酶有转乙酰酶，转磷酸酶或腺苷酸转移酶等，在这些酶的作用下，分别使氯霉素乙酰化，链霉素与卡那霉素磷酸化或链霉素腺苷酸化，这些被修饰的抗生素也失去了抗菌活性；④抗性菌株发生遗传变异，发生变异的菌株导致合成新的多聚体，以取代或部分取代原来的多聚体，如有些抗青霉素的菌株细胞壁中肽聚糖含量降低，但合成了另外的细胞壁多聚体等。抗性菌株所具特征，表明了它们耐药性的机理。

    抗生素在临床上用来治疗由细菌引起的疾病时，为了避免出现细菌的耐药性，使用时一定要注意：①第一次使用的药物剂量要足；②避免在一个时期或长期多次使用同种抗生素；③不同的抗生素 ( 或与其他药物 ) 混合使用；④对现有抗生素进行改造；⑤筛选新的更有效的抗生素，这样既可以提高治疗效果，又不会使细菌产生抗药性。

二、控制微生物的物理因素

    控制微生物的物理因素主要有温度，辐射作用、过滤、渗透压、干燥和超声波等，它们对微生物生长能起抑制作用或杀灭作用。

1 ．高温灭菌

    当温度超过微生物生长的最高温度或低于生长的最低温度都会对微生物产生杀灭作用或抑制作用。

① 高压蒸汽灭菌法

    高压蒸汽灭菌的温度越高，微生物死亡越快。通常情况下温度为 121.3 ℃ 。衡量灭菌效果的指标之一是十倍致死时间 (decimal reduction time ， D) ，即在一定的温度条件下，微生物数量十倍减少所需要的时间。温度愈高，十倍致死时间愈短。另外 D 值大小还随微生物的种类、生长时期、检测培养基的性质等因素有关。测量某种微生物在某个温度下的十倍致死时间是一个很复杂的过程，因为这种方法要测定活菌的数量。另一种比较容易测定的指标是热致死时间 (thennaldeathtime) ，即在一定温度下杀死所有某一浓度微生物所需要的时间。这样只要在一定温度下将待测样品加热处理不同时间后，分别与培养基混匀，然后培养，当所有细菌被杀死时，被培养的样品中没有细菌生长。待测样品中的微生物数量大 ( 即浓度高 ) ，杀死所有微生物所需的时间比杀死微生物浓度低的样品所需的时间长。因此当微生物的浓度一致时，可以通过比较热致死时间长短来衡量不同微生物的热敏感性。

②干热灭菌法

    对于一些玻璃器皿、金属用具等耐热物品还可以用干热灭菌法进行灭菌，但干热灭菌所需时间比湿热灭菌温度高和时间长。例如 171 ℃需要 1h ， 160 ℃需 2h ， 121 ℃需 16h 等。

③ 煮沸消毒

    即将待消毒物品如注射器、金属用具、解剖用具等在水中煮沸 15min 或更长时间，以杀死细菌或其他微生物的营养体和少部分的芽孢或孢子。如果在水中适当加 1 ％碳酸钠或 2 ％一 5 ％的石炭酸则杀菌效果更好。

④间隙灭菌法

    对于某些培养基，由于高压蒸汽灭菌会破坏某些营养成分，可用间隙灭菌法灭菌，即流通蒸汽 ( 或蒸煮 ) 反复灭菌几次，例如第一次蒸煮后杀死微生物营养体，冷却，培养过夜，孢子萌发，又第二次蒸煮，杀死营养体。这样反复 2 — 3 次就可以完全杀死营养体和芽孢，也可保持某些营养物质不被破坏。

⑤巴氏消毒法

    高压蒸汽灭菌适用于耐热材料的灭菌（如培养基、溶液等。）对于牛奶及其热敏感物质不适宜，因为高热破坏了食品的营养与风味。现在，牛奶或其他液态食品一般都采用超高温灭菌，即 135 — 150 ℃，灭菌 2 — 6s ，既可达杀菌和保质，缩短了时间，又提高了经济效益。

2 ．辐射作用

    辐射灭菌 (radiation Sterilization) 是利用电磁辐射产生的电磁波杀死大多数物质上的微生物的一种有效力法。用于灭菌的电磁波有微波、紫外线 (UV) 、 X 射线和 y 射线等，它们都能通过特定的方式控制微生物生长或杀死它们。例如微波可以通过热产生杀死微生物的作用；紫外线 (UV) 使 DNA 分子中相邻的嘧啶形成嘧啶二聚体，抑制 DNA 复制与转录等功能，杀死微生物； X 射线和 y 射线能使其他物质氧化或产生自由基 (OH · 、 H · ) 再作用于生物分子，或者直接作用于少物分子，打断氢键、使双键氧化、破坏环状结构或使某些分子聚合等方式，破坏和改变生物大分子的结构，以抑制或杀死微生物。

3 ．过滤作用

    高压蒸汽灭菌可以除去液体培养基中的微生物，但对于空气和不耐热的液体培养基的灭菌是不适宜的，为此设计了一种过滤除菌的方法。过滤除菌有三种类型。一种最早使用的是在一个容器的两层滤板中间填充棉花、玻璃纤维或石棉，灭菌后空气通过它就可以达到除菌的目的。为了缩小这种滤器的体积，后来改进为在两层滤板之间放入多层滤纸，灭菌后使用也可以达到除菌的作用，这种除菌方式主要用于发酵工业。第二种是膜滤器，它是由醋酸纤维素或硝酸纤维素制成的比较坚韧的具有微孔 (0.22 — 0.45um) 的膜，灭菌后使用，液体培养基通过它就可将细菌除去、由于这种滤器处理量比较少，主要用于科研。第三种是核孔滤器，它是由用核辐射处理的很薄的聚碳酸胶片 ( 厚 10um) 再经化学蚀刻而制成。辐射使胶片局部破坏，化学蚀刻使被破坏的部位成孔，而孔的大小则由蚀刻溶液的强度和蚀刻的时间来控制。溶液通过这种滤器就可以将微生物除去，这种滤器也全要用于科学研究。

4 ．高渗作用

    细胞质膜是一种半透膜、它将细胞内的原生质与环境中的溶液 ( 培养基等 ) 分开，如果溶液中水的浓度高于细胞原生质中水的浓度，那么水就会从溶液中通过细胞质膜进入原生质，使原生质和溶液中水的浓度达到平衡，这种现象为渗透作用，即水或其他溶剂经过半透性膜而进行扩散的现象称为渗透；在渗透时溶剂通过半透膜时受到的阻力称为渗透压。渗透压的大小与溶液浓度成正比。如纯水的 a w 值为 1 ，溶液中的溶质趋向于降低 a w 值，即溶液中含的溶质愈多，溶液中的 a w 值愈低，而溶液的渗透压愈高。细菌接种到培养基里以后，细胞通过渗透作用使细胞质与培养基的渗透压力达到平衡。如果培养基的渗透压力高 ( 即 a w 值低 ) ，原生质中的水向培养基扩散，这样会导致细胞发生质壁分离使生长受到抑制。因此提高环境的渗透压即降低 a w 值，就可以达到控制微生物生长的目的。例如用盐 ( 浓度通常为 10 ％一 15 ％ ) 腌制的鱼、肉、食品就是通过加盐使新鲜鱼肉脱水，降低它们的水活性，使微生物不能在它们上面生长；新鲜水果通过加糖 ( 浓度一般为 50 ％一 70 ％ ) 制成果脯、蜜饯也是降低水果的 a w 值，抑制微生物生长与繁殖，起到防止腐败变质的效果。

5 ．干燥

    水是微生物细胞的重要成分，占生活细胞的 90 ％以上，它参与细胞内的各种生理活动，因此说没有水就没有生命。降低物质的含水量直至干燥，就可以抑制微生物生长，防止食品、衣物等物质的腐败与霉变。因此干燥是保存各种物质的重要手段之一。

6 ．超声波

    超声波处理微生物悬液可以达到消灭它们的目的。超声波处理微生物悬液时由于超声波探头的高频率振动，引起探头周围水溶液的高频率振动，当探头和水溶液两者的高频率振动不同步时能在溶液内产生空当即空穴，空穴内处于真空状态，只要悬液中的细菌接近或进入空穴区，由于细胞内外压力差，导致细胞裂解，达到灭菌的目的，超声波的这种作用称为空穴作用；另一方面，由于超声波振动，机械能转变成热能，导致溶液温度升高，使细胞产生热变性以抑制或杀死微生物。目前超声波处理技术广泛用于实验室研究中的破细胞和灭菌。