基因重组——原核微生物的基因重组

 凡把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新重组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。

    基因重组是杂交育种的理论基础。由于杂交育种选用已知性状的供体菌和受体菌作为亲本。因此比诱变育种前进了一大步。同时也可消除某一菌株长期诱变导致产量上升缓慢现象。因此它是一种重要的育种手段。

 

原核微生物的基因重组

（一）转化 (transformation)

    转化是细菌中最早被发现的遗传物质转移形式。 l928 年 Griffith 用肺炎链球菌对小鼠的感染实验以及 10 多年后 Avery 等体外转化过程的实现，转化因子 DNA 的证实，是现代生命科学发展的重要起点。

1 ．几个概念

    转化 受体菌直接吸收了来自供体菌的 DNA 片段，通过交换把它整合到自己的基因组中，从而获得了新的遗传特性的现象。

    转化子（ transformant ） 受体细胞经复制分裂后出现了供体性状的子代。

    感受态 (competence) 细菌能够从周围环境中吸收 DNA 分子进行转化的生理状态。

2 ．转化的条件

    包括受体菌与外源 DNA 的条件。

    受体菌 只有处于感受态的细菌才能吸收外源 DNA 实现转化。细菌的感受态是一种生理状态，它可以通过感受态因子（细菌生长到一定阶段分泌一种小分子的蛋白质）在细胞间的转移而获得。这种感受态因子与细胞表面受体相互作用，诱导一些感受态 -- 特异蛋白表达，其中一种是自溶素，它的表达使细胞表面的 DNA 结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与 DNA 结合的活性。

    现在可用人工的方法提高受体菌感受态的水平，通过以 CaCl₂ 、 cAMP 等处理，后者可使感受态水平提高 10000 倍。

    外源 DNA 必须具备两个基本条件，即具有高相对分子质量和同源性：①转化 DNA 的相对分子质量通常在 1 × 10 ⁷ 以下，约占细菌染色体组的 0.3 ％，否则活性丧失；多数研究中，基因转移使用的是双链线性 DNA ，某些单链、共价闭合环状 DNA 也可用于转化；②亲缘关系越近， DNA 的纯度越高，则转化率越高。

3 ．转化过程

    主要通过 3 个步骤完成。

    感受态细胞的建立 可用人工方法提高受体菌的感受态水平，通常以 CaCl ₂ 、 cAMP 等处理菌体，后者可使感受态水平提日 l0 000 倍。

    DNA 的结合和摄取 首先是供体双链 DNA 与受体细胞壁上的接受位点相结合。此反应的最初是可逆的，但随着与细胞膜蛋白的进一步作用，其与细胞壁的结合则变得十分稳定而不可逆。随后其中一条链被细胞表面上的核酸酶降解，降解产生的能量协助把另一条链推进受体细胞。亦发现有完整的双链被摄取的情况，如革兰氏阴性菌——嗜血杆菌。

    转化因子与染色体重组 当单链进入受体细胞后，便与双链结构的受体染色体 DNA 同源片段发生交换重组。即与受体菌 DNA 整合，形成供体 DNA-- 受体 DNA 复合物，再通过 DNA 复制和细胞分裂而表现出转化性状，形成转化子。

    能够发生转化的微生物有：肺炎链球菌、嗜血杆菌属、芽孢杆菌属、假单胞杆菌属、奈瑟氏球菌属、葡萄球菌属和根瘤菌属等 20 多种菌。转化性状也多样：如形态变化、荚膜物质、糖发酵、耐药性、抗原性、致病力、代谢产物、营养需要等的变化。一般转化率为 0.1 ％一 1 ％。

    如果把噬菌体或其他病毒的 DNA （或 RNA ）抽提出，用它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒后代，这种特殊的转化称为转染。

( 三 ) 转导 (transduction)

    1952 年 Zinder 和 Lederberg 在验证鼠伤寒沙门氏菌是否也存在接合现象时发现了转导现象。

    通过完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的 DNA 片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新性状的受体细胞，称为转导子 (transductant) 。携带供体部分遗传物质 (DNA 片段 ) 的噬菌体称为转导噬菌体。在噬菌体内仅含有供体菌 DNA 的称为完全缺陷噬茵体；在噬菌体内同时含有供体 DNA 和噬菌体 DNA 的称为部分缺陷噬菌体 ( 部分噬菌体 DNA 被供体 DNA 所替换 ) 。根据噬菌体和转导 DNA 产生途径的不同，可将转导分为普遍性转导和局限性转导。

1 ．普遍性转导 (general transduction)

    通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何 DNA 小片断的“误包”，而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。

    普遍性转导的机制——“包裹选择模型”，当噬菌体侵染敏感细菌并在细菌内大量复制增殖时，亦把寄主 DNA 降解为许多小的片段，在装配时，少数噬菌体 (10 -6 一 10 -8 ) 错误地包装了宿主的 DNA 片段并能形成“噬菌体”，这种噬菌体称普遍性转导噬菌体 ( 为完全缺陷噬菌体 ) 。随着细菌的裂解，转导噬菌体也被大量释放。当这些转导噬菌体再次侵染受体菌时，其中的供体 DNA 片段被注入受体菌。

    如果该 DNA 片段能与受体菌 DNA 同源区段配对，通过遗传物质的双交换而进行基因重组并形成稳定的转导子，称完全普遍性转导。如鼠伤寒沙门氏菌的 P22 噬菌体、大肠杆菌的 P1 噬菌体和枯草芽孢杆菌的 PBS1 和 SP10 等噬菌体中都能进行完全转导。

    如果该 DNA 片断不能与受体菌 DNA 进行交换、整合和复制，只以游离和稳定的状态存在，而仅进行转录、转译和性状表达，称流产转异。发生流产转导的细胞在其进行分裂后，只能将这段外源 DNA 分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因转录、转译而形成的少量产物 -- 酶，因此在表型上仍可出现轻微的供体菌特征，每经分裂一次，就受到一次“稀释”。所以能在选择培养基上形成微小菌落就成了流成转导子的特点。

2 ．局限性转导 (specialized transduction)

    通过部分缺陷噬的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象）。转导后获得了供体部分遗传特性的重组受体细胞称为局限转导子。

(1) 局限性转导的机制——“杂种形成模型” λ噬菌体的线状双链 DNA 分子的两端为 12 个核苷酸单链（粘性未端 cos 位点），在溶源状态下，以前噬菌体状态存在于细胞染色体上。被诱导后，在裂解细菌时，其以粘性末端形成的环状分子通过滚环复制形成一个含多个基因组的 DNA 多联体，以 2 个 cos 位点之间的距离决定其包装片段的大小而进行切割、包装，最终形成转导噬菌体。在极少数情况下 ( 约 10 -5 ) ，在前噬菌体两端邻近位点上与细菌染色体发生错误的切割，使其重新形成的环状 DNA 中，同时失去前噬菌体的一部分 DNA 和增加了一段相应长度的细菌宿主染色体 DNA ，这样形成的杂合 DNA 可正常被包装、复制。形成的新转导噬菌体称为部分缺陷噬体。因为λ前噬菌体位点两端是细菌染色体的 gal + ( 发酵半乳糖基因 ) 和 bio + ( 利用生物素基因 ) ，故形成的转导噬菌体通常带有 gal + 或 bi0 + 基因，故这些部分缺陷噬菌体表示为λ dga1( 缺陷型半乳糖转导噬菌体 ) 或λ dbio( 缺陷性生物素转导噬菌体 ) 。这些转导噬菌体可重新侵入受体菌，侵入后，噬菌体 DNA 与受体菌的 DNA 同源区段配对，通过双交换而整合到受体菌的染色体组上，使受体菌获得了供体的这部分遗传特性。

（ 2 ）局限性转导中的低频转导与高频转导 低频转导 (LFT) ：由于宿主染色体上进行不正常切离的频率极低，因而在裂解物中所含的部分缺陷噬菌体的比例是极低（ 10 -4 --10 -6 ）的，这种裂解物称为 LFT 裂解物。 LFT 裂解物在低 m.o.i(multiplicity of infection) 情况下感染宿主，就可获得极少量的转导子。高频转导 (HFT) ：形成转导子的频率很高，理论上可达 50 ％，故称之为高频转导。其原因是因为供体菌为双重溶源菌，它同时有两种噬菌体整合在细菌的染色体上。例如，大肠杆菌 K12 株，其双重溶源菌为 E.coli K12( λ / λ dg), 即其前噬体体有λ和λ dg 为缺陷噬菌体，带有供体 gal + 基因，但丢失了部分噬菌体本身的 DNA ；而λ噬菌体为正常噬菌体，不带 gal 基因，但起辅助作用，称为辅助噬菌体，可弥补λ dg 的不足，使λ dg 也能成为“完整噬菌体”而释放。这样，一个细菌便可同时等量地释放出λ dg 和λ两种噬菌体，这时的裂解物称为 HFT 裂解物，当用低   m.o.i 的 HFT 裂解物去感染另一个 E.coligal - 受体菌，是可高频率的把它转化为能发酵乳糖的 E.coligal + 转导子。这种方式称为高频转导。

    当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体的基因整合到宿主的基因组，而使后者获得了除免疫以外的新性的现象，称为溶源转变。

( 三 ) 接合 (conjugation)

    指供体菌和受体菌完整细胞间的直接接触，而实现大段的 DNA 传递现象。

    Iederberg 和 Tatum 于 1946 年设计了一个有名的实验，才证明了原核生物的接合现象。他们筛选出了两种不同营养缺陷型的大肠杆菌 K12 突变株，其中 A 菌株是 met- 、 bio- ， B 菌株是 thr- 、 Leu- ，将它们在完全培养基上混合培养后，再涂布于基本培养基上。结果发现，在基本培养基上出现了 met + 、 bi0 + 、 thr + 、 1eu + 的原养型菌落 ( 约为 10 -7 ) ，而分别涂布的两种亲本菌株对照组都不出现任何菌落。进一步的实验证实，上述遗传重组的形成，是两个亲本细胞接合以后发生基因重组的结果。在细菌中，接合现象发研究最清楚的是 E.coli ，研究发现 E.coli 是有性别分化的，决定性别的是一种质粒，即 F 因子。现在根据 E.coli 细胞中是否存在 F 因子以及在细胞中的存在方式不同，可把大肠杆菌分成以下四种类型。

    F + 菌株 F 因子以游离状态存在，可独立于染色体进行自主复制。一般有 1-4 个，且细胞表面有相当数量的性菌毛。

    F - 菌株 不含 F 因子，无相当数量的性菌毛。

    Hfr 菌株 F 因子整合在宿主染色体的一定部位，并与宿主染色体同步复制。发现 Hfr 与 F - 菌重组的频率要比 F + 菌与 F - 菌重组的频率高得多。

    F ′菌株 因为 F 因子整合到染色体上是一种可逆过程，当 F 因子从 Hfr 菌染色体上脱落时，会出现一定概率的错误基因交换，从而使 F 因子带上宿主染色体的遗传因子，这时的 F 因子称为 F ′因子。

    几种接合的结果

    F+ × F- 接合 通过 F + 菌产生的性菌毛把两者连接在一起，并在细胞间形成胞质桥 ( 或称接管 ) ， F 因子通过胞质桥进入受体细胞，使重组体从 F - 变成了 F + 菌。其主要过程是， F 因子的一条 DNA 单链断裂 ( 在特定位点上 ) 、解链，并单向转移进入受体细胞，在此作为模板而形成新的 F 因子；另一条在供体细胞内的 DNA 链也成为模板并以滚环模型形式复制；最终供体菌及受体菌均成为 F + 菌。

    Hfr × F- 接合 当 Hfr 与 F- 菌株发生接合时， Hfr 的染色体双链中的一条单链在 F 因子处发生断裂，由环状变为线状， F 因子则位于线状单链 DNA 之末端。整段线状染色体也以 5- 末端引导，等速转移至 F - 细胞。在没有外界因素干扰的情况下，这一转移过程的全部完成约需 100 分钟。实际上由在转移过程中，使接合中断的因子很多，因此这么长的线状单链 DNA 常常在转移过程中发生断裂。所以处在 Ffr 染色体前端的基因，进入 F- 的几率就越高，这类性状出现在接合子中的就越早。由于 F 因子位于线状 DNA 的末端，进入 F- 细胞的机会最少，故引起 F- 变成 F+ 的可能性也最小。因此 Hfr 与 F- 接合的结果其重组频率虽最高，但转性频率却最低。

    F ′与 F- 接合 通过 F ′与 F- 的接合就可以使后者变成 F ′。它既可使后者前者的 F 因子，同时双获得前者的部分遗传性状。

（四）原生质体融合（ protoplast fusion ）

    通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并进而发生遗传重组以产生同时带有双亲性状的、遗传性稳定的融合子（ fusant ）的过程 .

    能进行原生质体融合的细胞是极其广泛的，不仅包括原核生物，而且还包括各种真核细胞。原生质体融合的优越性在于：

1 ．它打破了微生物的种属界限，可以实现远缘菌株的基因重组。 1981 年 Yamada 有 PEG 诱导酵母原生质体与细菌细胞成功的融合，并使其固氮作用或光合作用实现了不稳定的表达。

2 ．原生质融合可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组体的机会，有利于提高育种速度。

    此外原生质体融合技术还可用于研究细胞质遗传、核质关系等问题，因此原生质体融合技术在生产实践及理论研究上均有具有重要意义。

    原生质体融合技术及育种步骤

1 ．原生质体的制备

    制备原生质体是保证实现原生质融合技术的关键。主要是要去除细胞壁。

2 ．原生质体再生

    是指去壁后的原生质体能重建细胞壁，恢复细胞完整形态，并能生长、分裂的过程。这是原生质融合育种的必要条件。通常在原生质体融合前要测定原生质体的再生率，以此分析其融合率不高是由于双亲株原生质体本来就没有活性或再生率低，还是由于融合条件不适所致。因此测定原生质体形成率和再生率不仅可作为检查、改善原生质体形成和再生条件的指标，也是分析融合实验结果，改善融合条件的一个重要指标。

3 ．原生质体融合

    原生质体融合方法 主要有生物助融（通过病毒聚合剂如仙台病毒等病毒和某些生物提取物等使原生质体融合）、物理助融（离心沉淀、电脉冲等）、化学助融（通过化学助融剂如 PEG 加 Ca 2+ ）。

4 ．融合子的检出与鉴定

    原生质体融合育种的主要目的在于迅速准确地检出各种类型的融合子，并通过鉴定、筛选等步骤，及时选出稳定高产的融合子。

①融合子的检出

    直接检出法 将融合液涂布于无双亲株生长所必要的营养物或存在抑制双亲生长的抑制物的再生平皿上。

    间接法 用影印法

②融合子的鉴定

    经过传代选出稳定融合子，可从形态学、生理生化、遗传学及生物学等几方面进行鉴定。如菌落形态和颜色变化，代谢产物的产量， DNA 含量分析等。