菌种的衰退、复壮和保藏

 在微生物的基础研究和应用研究中，选育一株理想菌株是一件艰苦的工作，而要保持菌种的遗传稳定性更是困难。菌种退化是一种潜在的威胁，因此引起人们的研究与重视。

一、菌种退化现象

    菌种退化（ degeneration ）是指群体中退化细胞在数量上占一定数值后，表现出菌种生产性能下降的现象。常表现为，在形态上的分生孢子减少或颜色改变，甚至变形，如放线菌和霉菌在斜面上经多次传代后产生了“光秃”型，从而造成生产上用孢子接种的困难；在生理上常指产量的下降，例如，黑曲霉的糖化能力、抗生素生产菌的抗生素发酵单位下降等。造成菌种退化的原因主要有：

( 一 ) 自然突变

    微生物与其他生物类群相比最大的特点之一就是有较高的代谢繁殖能力，在 DNA 大量快速复制过程中，因出现某些基因的差错从而导致突变发生，故繁殖代数越多，突变体的出现也越多。一般来说，微生物的突变常常是负突变，是指使菌种原有的优良特性丧失或导致产量下降的突变。只有经过大量的筛选，才有可能找到正突变。

( 二 ) 环境条件

    环境条件对菌种退化的影响，如营养条件，有人把泡盛曲霉的生产种，在 3 种培养基上连续传代 10 次，发现不同培养基和传代次数对淀粉葡萄糖苷酶的产量下降有不同影响，说明营养成分影响菌种退化的速度。环境温度也是重要的作用因素。例如，温度高，基因突变率也高，温度低则突变率也低，因比菌种保藏的重要措施就是低温。其他环境因子，如紫外线等诱变剂也可加速菌种退化。

（三）衰退的防止

①控制传代次数；②创造良好的培养条件；③利用不同类型的细胞进行接种；④采用有效的菌种保藏方法。

（四）退化菌种的复壮

    因为在退化的菌种中仍有一些保持原有菌种特性的细胞，故有可能采取一些相应措施，使这些细胞生长、繁殖，以更新退化的菌株，称之为菌种的复壮。常用方法是①纯种分离；②通过宿主体内生长进行；③淘汰已衰退的个体。

二、菌种的保藏

    经诱变筛选、分离纯化以及纯培养等一系列艰苦劳动得到的优良菌株，能使其稳定地保存、保持原有的特性、不死亡、不污染，这就是菌种保藏的任务。

( 一 ) 原理

    人为地创造合适的环境条件，使微生物的代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工环境主要从低温、干燥、缺氧 3 方面设计。

（二）常用方法

    菌种的保藏方法多样，采取哪种方式，要根据保藏的时间、微生物种类、具备的条件等而定。下面着重介绍几种常用的保藏方法。

1 ．斜面保藏法

    将菌种接种在试管斜面培养基上，待菌种生长完全后，置于 4 ℃ 冰箱中保藏，每隔一定时间再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏。对细菌、放线菌、霉菌和酵母菌均可采用。此方法简单、存活率高，故应用较普遍。其缺点是菌株仍有一定的代谢强度，传代多则菌种易变异，故不宜长时间保藏菌种。

2 ．液体石蜡覆盖保藏法

    为了防止传代培养菌因干燥而死亡，也为限制氧的供应以削弱代谢水平，在斜面或穿刺的培养基中覆盖灭菌的液体石蜡。主要适用于霉菌、酵母菌、放线菌、好氧性细菌等的保存。霉菌和酵母菌可保存几年，甚至长达 10 年。本法的优点是方法简单不需特殊装置。其缺点是对很多厌氧细菌或能分解烃类的细菌的保藏效果较差。液体石蜡要求选择优质无毒，一般为化学纯规格。可以在 121 ℃ 湿热灭菌 20min 。要求液体石蜡的油层高于斜面顶端 1cm ，垂直放在 4 ℃ 冰箱内保藏。

3 ．载体保藏法

    使微生物吸附在适当的载体上 ( 土壤、砂子等 ) 进行干燥保存的方法。最常用的有砂土保藏法。主要用于能形成孢子或孢子囊的微生物 ( 真菌、放线菌和部分细菌 ) 的保存。此法简便，保藏时间较长，微生物转接也较方便，故应用范围较广。

4 ．冷冻干燥保藏法

    这是最佳的微生物菌体保存法之一，保存时间长，可达 10 年以上。低温冷冻可以用普通 -20 ℃ 或更低的 -50 ℃ 、 -70 ℃ 冰箱，用液氮 (-196 ℃ ) 更好。无论是哪种冷冻，在原则上应尽可能速冻，使其产生的冰晶小而减少细胞的损伤。不同微生物的最适冷冻速度不同。为防止细胞被冻死，

    保存液中应加些保护剂，例如甘油、二甲亚矾等，它们可透入细胞，通过降低强烈的脱水作用而保护细胞；大分子物质如脱脂牛奶、血清白蛋白等，可通过与细胞表面结合的方式防止细胞膜受冻伤。其缺点是手续麻烦、需要条件高。

    另外还有悬液保藏法、寄主保藏法、液氮保藏法等。