免疫学的研究方法（1）

 免疫学实验技术随着免疫学学科的发展而得到不断改进和完善，并对免疫学学科的发展起着极大的推动作用。现在，免疫学实验技术已成为生物学、医学及其他学科实验研究的一种重要手段，特别在一些微量的、特异性要求高的测定中更显示了其特有的优越性。免疫学的研究方法多、范围广。

一、血清学反应

    在体外进行的体液免疫反应一般采用血清进行试验，称为血清学反应。血清学反应既可用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。故常用来进行体外体液免疫功能的测定、转染病的诊断、微生物的分类鉴定以及广泛应用于生物化学、遗传学、胚胎发育学、病毒学、细菌学等各学科的研究之中。

    抗原抗体反应的一般规律：特异性、可逆性、定比性、阶段性、条件性。

( 一 ) 凝集反应

    细菌、红细胞等颗粒性抗原与其特异性抗体结合后，在有电解质存在时，互相凝聚成肉眼可见的凝集小块，称为凝集反应。参与凝集反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。

    在凝集反应中，单个抗原体积大，而抗原总面积小，为使抗原和抗体间充分结合，常须稀释抗体 ( 抗血清 ) 。

1 ．直接凝集反应

    有玻片法和试管法。玻片法简便、快速，是一种定性试验，可用于菌种鉴定、测定血型等。试管法可定量判断血清中抗体的相对含量，可用于协助临床诊断或供流行病学调查。

2 ．间接凝集反应

    将可溶性抗原 ( 或抗体 ) 吸附于一种载体颗粒表面，然后与抗体 ( 或抗原 ) 结合，在有电解质存在的适宜条件下，可发生凝集反应，称为间接凝集反应。

( 二 ) 沉淀反应

    可溶性抗原，如细菌的外毒素、内毒素、血清、病毒的可溶性抗原和组织浸出液等与相应抗体结合，在适量电解质存在下，聚合成肉眼可见的白色沉淀，称为沉淀反应。其抗原称为沉淀原，抗体称为沉淀素。在沉淀反应中，抗原分子较小，单位体积内所含的量多，与抗体结合的总面积大，为了使抗原抗体按比例结合，常稀释抗原。

1 ．环状沉淀反应

    在小试管内先加入已知抗血清，然后小心加入待检抗原于血清上表面，使之成为分界清晰的两层．一定时间后，凡两层液面交界处出现白色环状沉淀者即为阳性反应。此法简单、敏感，所需被检材料少，可用作抗原的定性试验如炭疽病的诊断、血迹鉴定、沉淀素的效价滴定等。

2 ．絮状沉淀反应

    抗原与抗血清在试管内混合，在有电解质存在时，抗原抗体复合物可形成混浊沉淀或絮状凝聚物。此反应可用于诊断螺旋体引起的梅毒病 (Kahn 氏试验 ) 以及用以滴定毒素、类毒素和抗毒素的效价。

3 ．免疫扩散

    琼脂凝胶呈多孔结构，能允许各种抗原抗体在其中自由扩散。抗原抗体在琼脂凝胶中扩散由近及远形成浓度梯度，当两者在比例适当处相遇即发生沉淀反应，形成沉淀带。由于一种抗原抗体系统只出现一条沉淀带，故本反应能将复合抗原成．分加以区分，从而可了解抗原复合物的组成，并可将所得沉淀用特异方法染色及用生物活性 ( 酶活性 ) 、同位素标记等方法鉴定抗原成分。按其操作技术特点，可以分为单扩散和双扩散。

    单扩散是抗原抗体中一种成分扩散，而双扩散则是两种成分在凝胶内彼此都扩散。下面主要介绍双扩散：用 1 ％琼脂浇成厚 2 -3mm 的凝胶板，在其上按一定图形打圆孔或长方形槽，在相邻孔 ( 槽 ) 内滴加抗原和抗体，在饱合湿度下，扩散数日，观察沉淀带。如图所示，每个抗原与抗血清反应生成的沉淀弧融合，表明上面两个孔中的抗原是相同的；在 B 中，形成两条交叉的沉淀带，表明上面两孔中的抗原不相同；在 C 中，两个抗原有相同的部分，但有部分差别，且主要抗原可干扰次要抗原的扩散，形成不完全融合的沉淀带，并向次要抗原方向形成一个交叉角；在 D 中的情况则表明 ab 抗原孔中含有两个抗原，其中一个抗原与右边抗原孔中的抗原成分相同，而另一个抗原成分是独立的，即 ab 孔中的抗原成分比 a 孔中抗原成分复杂。双扩散可用来鉴定未知样品的组分，比较不同样品的抗原性。根据扩散距离测定抗原的含量以及检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、 HBsAg 等。但此法敏感性不高，且需时较长。

4 ．免疫电泳

    将琼脂双扩散与琼脂电泳技术相结合的方法。待检样品 ( 含复合抗原 ) 先在琼脂凝胶板上电泳，将抗原的各个组分在板上初步分开，然后再在点样孔一侧或两侧打槽，加入抗血清，进行双向双扩散。电泳迁移率相近而不能分开的抗原物质，又可按扩散系数不同形成不同的沉淀带，从而进一步加强了对复合抗原组分的分辨能力。

    免疫电泳敏感性高，特异性强，近年来在生物学、生物化学、微生物学、免疫学及临床医学等领域中广泛应用。可用来进行抗原与抗体成分的研究、生物制品纯度分析、甲胎蛋白和肝炎协同抗原 (HAA) 的诊断等，并在此基础上又发展成为对流免疫电泳和火箭免疫电泳等。

( 三 ) 免疫荧光技术

    抗体与某些特定的荧光物质结合而成为荧光标记抗体，仍能特异性地结合抗原成为荧光标记的抗体抗原复合物，在荧光显微镜下可被观察到。荧光素与抗体结合能侦察出抗原所在部位，故可用来进行抗原的定位或定性测定。

( 四 ) 放射免疫测定法

    是将放射性同位素的灵敏性和免疫学抗原抗体反应的特异性结合起来的一种技术。此法是一种定量分析方法，能检测生物体液中的微量免疫活性物质，具有灵敏、特异、精密、准确和快速等特点。

( 五 ) 补体参与的抗原抗体反应

    这是一种有补体参与，并以绵羊红细胞和溶血素作指示系统的、灵敏度很高的抗原抗体反应。

    其原理：①补体可与任何抗原抗体的复合物相结合；②指示系统如遇补体后就会出现明显的溶血反应。

    反应过程：先将被检系统的抗原、抗体和补体加在一起， 37 ℃水浴 30min 或 4 ℃冰箱过夜，然后加入红细胞和溶血素，继续作用一段时间后观察结果。若不发生溶血，即判为补体结合反应阳性，表示被检系统中的抗原和抗体发生了特异性结合，．并结合了补体。若发生了溶血，则为补体结合反应阴性，表示被检系统中抗原、抗体末结合不是特异的，末激活补体，所以当加入指示系统后，在绵羊红细和溶血素结合后，激活了补体，发生了溶血。本反应为严格的定量试验，除待检抗原 ( 或抗体 ) 外，其余成分均需事先滴定，以定量参加反应，其敏感性和特异性均较高，常用于诊断病毒性疾病。