不同环境温度下的大肠杆菌数量监测及生存机制研究

    环境监测中，生物监测能准确地反映环境污染物对生物和人体是否有害以及其影响有多大，具有物理-化学监测无法替代的优越性。由于生物监测在我国起步较晚，尚没有形成法定的生物监测指标体系，目前的环境质量定量考核、排污收费、许可证发放等环境管理重要环节除了细菌学个别指标外，大多数生物监测指标末能应用。然而随着经济的发展，城市人口的急剧增加，随之而来的大量未经处理的生活污水直接排放，其中携带的大量有害的病原菌、病毒，必定会对生态环境和人民身体健康产生较大的危害。例如1998年上海甲肝大流行，其原因就是食用受人粪便污染的毛蚶造成的。因而加强对目前生物监测中仅有的法定指标大肠杆菌的监测，对于环境保护和确保人民身体健康都具有重大的意义。然而目前我国绝大多数的环境监测部门都采用经典的多管发酵法，在特定的环境条件下就有其一定的局限性。本文就不同环境温度下大肠杆菌监测的各种方法进行了比较和研究。

 

1.材料与方法

 

1.1实验菌株

    实验菌株为埃希氏大肠杆菌Escherichia coli ，由中国药品生物制品检定所菌种室提供。

 

1.2实验水体

    容积为1L的三角瓶内装800ml 经0.2μm孔径的微孔滤膜过滤并经121℃蒸汽灭菌20min的自来水， 用带有2ml移液管橡皮塞密封。实验过程中的取样用注射器通过移液管头上的密封的乳胶头取样。

    菌种经液体营养培养剂在37℃下振荡培养24h，分别加入实验水体中，使细菌浓度为 10⁸个 /ml。

    将该实验装置分别置于5℃和25℃和温度环境中，定时取样计数。

 

1.3计数方法

 

    平板计数法：采用常规涂布平板法，37℃24h后计数。培养基为营养琼指和伊红美兰琼脂。

    多管发酵法：采用五管法，培养剂为液体EC培养基。

    细菌总数：采用AODC法， 具体操作按徐怀恕方法进行。

    活菌直接计数：采用Kogure等方法：向水样加入0.002%萘啶酮酸（Sigma 公司）和0.025%酵母膏，在37℃下培养6-24h，加入甲醛（最终浓度为2%）固定，再按AODC法镜检计数。

 

2. 结果与讨论

    很长时间以来，人们都用培养法来评价细菌的数量，20世纪70年代以后随着检测细胞活性和放射性自显影等新技术的应用，科学家们发现一些细菌在受到环境压力时，细菌会失去在常规培养基上的生长能力，但细菌仍是活的。当人们监测环境的污染程度时，这种活的非可培养状态就有特别重要的意义。各国科学家对此进行了大量的研究，很多种细菌如弧菌属的大部分种:沙门氏气单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、产气肠杆菌、粪链球菌、恶臭假单胞菌、 索氏志贺氏菌、空肠弯曲杆菌等等都被证实能够进入活的非可培养状态，并且随着研究的深入这类细菌的种类正在不断地增加，可以肯定污水中也存在大量的这类细菌，对于这些细菌的活的非可培养状态的研究是正确全面评价污染物排放对生态环境影响的一个重要方面。我们以埃希氏大肠杆菌（E.coli）为研究对象，以5℃和25℃为环境温度，进行污水细菌生存机制的研究。

 

2.1  5℃环境中的细菌生存

E.coli 在5℃环境中的生长情况见表1

 

表1 5℃下的大肠杆菌数量（单位：个/ml）

 

在整个试验过程中， 细菌总数（ AODC 法） 和活菌数（DVC法）变化不大， DVC值比AODC 值低一个数量级左右，而通过多管发酵法和涂布平板法的数量，随着时间的推移逐步减少。从实验初期的10⁴个/ml减少到10-100个/ml。直接镜检法测得的细菌总数不变， 而培养法测的细菌数明显下降， 说明细菌正逐步失去“ 可培养性” ，进入一种非可培养状态。但是可培养细菌数量的减少比较缓慢，直到实验结束时（ 第56天） 还维持 10-100个/ml， 没有完全进入非可培养状态。

 

2.2  25℃环境中的细菌数量

 

E.coli在25℃ 的生长见表2，可以看出细菌总数（AODC法）和活菌数（DVC 法）在实验期间数量变化不大，DVC值比AODC值低一个数量级左右，与5℃情况相同。相对而言， 多管发酵法和涂布平板法的数量随着时间的推移，以较快的速度减少，第29天可培养数为零， 说明完全进入了非可培养状态。

 

表2   25℃下的大肠杆菌数量（单位：个/ml）

 

 

    关于E.coli的非可培养状态，Colwell、Oliver、Linder、Byrd和中国的徐怀恕等人均有报道。 从本试验的数据来看， 低温5℃虽然能使可培养细菌数减少， 但速度很缓慢，在第56d 还维持着10-100个/ml的浓度，而在25℃下，可培养细菌数反而迅速降低，第29d时已降为零。G.Bogosian 在研究E.coli在河水中的死亡率时，发现在没有灭菌的土壤浸液中E.coli在4℃下100d时细菌数量为100个/ml(起始浓度为10⁹个/ml） ， 在 37℃时12天就达到了这个数量。与我们的实验结果相似，可以认为在较高的温度下容易进入非可培养状态，在较低的温度下反而需要比较长的时间。 同样的情况Rollins和Colwell在1986年作了报道， 他们的实验菌种为C.jejuni,在37℃时该菌在10d左右的时间内完全进入了非可培养状态，而在 4℃时在120d后却还保持着较高的可培养菌数。1992年Medema重复了这个试验并作了报道。另外，Hussong在1987年对L.pheumophular 的非可培养研究中， 得到了类似的结果。因此， 低温虽然是许多细菌（ 如Vibrio vulnificus ） 进入非可培养状态的重要条件，但是不同的细菌并不都是如此。既使同种细菌间进入非可培养状态的时间也不尽相同。

 

3.小结

    以埃希氏大肠杆菌E.coli 为试验对象，研究了细菌在不同温度下的生存机制，结果发现：该细菌进入水体后，无论在低温5℃下还是在高温25℃下都会进入非可培养状态，即用常规培养法难以检测， 但细菌仍是活的。因而污水排放后，大量的细菌可能以活的非可培养状态存在，用常规的监测方法难以正确表达其数量。有的还会寄生在浮游生物体内，在适宜的环境条件下又会复活。这就要求我们在日常工作中除了常规监测，应尽可能地应用新的技术如：荧光显微镜直接镜检法、荧光单克隆抗体培养等监测手段，努力作到客观、准确、 全面地反映污染排放对生态环境的影响以及对人民生命健康的潜在威胁。