国产MH琼脂质量控制的探讨

MH琼脂( M u l l e r   H i n t o n   A g a r ) 是至今被国际公认和 WHO推荐的最适用于琼脂纸片扩散法 ( K i r b y--B a n e r 纸片扩散法) 测定细菌对抗生素敏感性的培养基。究其原因，主要由于MH琼脂培养基产品批间药物敏感试验重复性比其他培养基好；接种于 MH琼脂培养基上， 绝大多数致病菌生长良好；MH琼脂培养基对磺胺、甲氧苄胺嘧啶、四环素的抑制成分含量低。国内外有关药物敏感试验的大量数据是由 M H琼脂作为培养基试验得出的。 

1   国产MH琼脂培养基作为药敏试验培养基使用存在的主要问题

1.1 批间产品的稳定性

国产MH琼脂培养基批间产品稳定性不够，主要是MH琼脂中主要原料的质量不稳定性造成的：①酸水解酪蛋白( C a s e i n  Hydrolysate ) ，水解工艺的不稳定性。②牛肉浸出粉( Beef ， Dehydrated  infusion From) ，混有经酶消化的牛肉膏粉。③琼脂，去除游离的矿物质，才能保证药敏试验的结果。琼脂的凝胶强度及在培养基中的浓度均能影响药物的扩散 。④培养基碱性增加能扩大氨基糖苷类药物的抑菌圈。酸性增加能扩大四环素的抑菌圈。MH琼脂一般pH为7.2～ 7.4，接近人体体液的p H值。

1 .2 拮抗物质

MH琼脂原料中存在过量的被测药物的拮抗物质：① 胸腺嘧啶核苷( Thymidine )胸腺嘧啶( Thymine ) 抑制磺胺类药和甲氧苄胺嘧啶的活力。胸腺嘧啶核苷对TMP的抑制是胸腺嘧啶的10倍。② MH琼脂中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷水平是否足够低， 是否在合格范围内， 美国国立临床实验室标准委员会( NCCLS ) 规定可用 TMP—SMZ纸片鉴定，它对粪肠球菌 ATCC 29212的抑菌圈直径应 ≥2 0 m m， 且边缘清晰，这是检测 MH琼脂是否合格的标准之一( 表 1 ) 。 

 

表1 标准菌株在6种MH琼脂上对TMP-SMZ的抑菌圈50次测试平均值和测试范围（mm） 平均值用X表示

 

 

 

 

2 0 0 7年上海市疾控中心培养基室用 3株标准菌株在不同批次自配 M H琼脂上对 T M P—S MZ进行了抑菌圈测试，结果见表2 。自配 MH琼脂对粪肠球菌 ATCC29212的平均抑菌圈为20.5 m m，表明原料中胸腺嘧啶和胸腺嘧啶核苷的含量是基本合格的。3株标准菌株抑菌圈的变异系数( CV) 均小于5 ％， 表明国产自配MH琼脂的稳定性还是可以的。 

表2   标准菌株在不同批次自配MH琼脂上对TMP-SMZ的抑菌圈测试结果（mm）

 

 

1.3二价离子

Mg²⁺  、Ca²⁺在培养基中的浓度变化，影响四环素、多粘菌素、氨基糖苷类药物的抗菌活性。含量过高，使抑菌圈变小；含量过低，使抑菌圈变大。特别对铜绿假单胞菌的敏感性影响较大。一般认为，1000  mL培养基中Ca²⁺  50～200 mg ， Mg²⁺  20～35 mg较为适宜。Cu²⁺、 Zn²⁺ 、 Sn²⁺在培养基中只要微量存在，青霉素就会很快分解成青霉素噻唑酸而失去抗菌活性。SO₄^2- ，琼脂中极易残存此子， 其可与多粘菌素、新霉素等药物发生化学反应， 从而影响药物的扩散和抗菌活性  。 

1.4其他

氨基甲酸乙脂( Urethane )、叶酸、葡萄糖、某些蛋白胨和氨基酸对磺胺类药均有不等的拮抗作用。 

2 干扰 MH琼脂质量的外界因素

2.1药敏纸片 

标准纸片直径为1／4时 ( 约6.35mm) ，重量为 ( 30± 4 ) mg／cm² ，吸水性为重量的2.5～ 3.0倍， pH= 7.0 ，无影响抗菌活性的二价离子。抗生素含量必须符合 NCCLS规定的浓度。长期保存应置于 -2 0 ℃以下低温冰箱。使用前应将使用量纸片置 0 ~ C预温  。 

2.2 细菌接种量

细菌接种量是控制试验重复性的主要因素。一般接种量是0.5麦氏单位的菌液约0.1mL 。加大菌量可使抑菌圈缩小， 反之能使抑菌圈扩大 。 

2.3 平皿制备与保存

9.0 c m平皿倾注培养基一般为 25～ 30 mL ， 15cm平皿为60 mL， 厚度均应达4mm。如大量配制应对产品抽样，于3 0～ 35℃， 24 h作无菌试验培养。平皿应置于密封塑料袋内放入冰箱， 2～7℃保存。有效期为7 d。 

2 .4 培养温度和时间

最佳培养温度为 35℃， 培养时间为16～18 h 。温度偏低细菌所需生长时间延长，造成抑菌圈变大； 温度超过 35℃， 可使某些抗生素如：苯唑青霉素、甲氧苯青霉素等失效。有学者发现，在35℃培养时，对甲氧苯青霉素耐药的金黄色葡萄球菌在 3 7 ℃时可不显示耐药  。 

3 推荐的 MH琼脂质控方法

3.1培养基制备

按干粉培养基说明，正确称量和加蒸馏水或去离子水。煮沸溶解后，置 121℃ 15 mi n灭菌。冷至5 5℃左右， 倾注无菌平皿。9c m平皿约2 5～ 3 0 m L ，达到厚度4 m m。MH琼脂最终 pH在 2 5 ℃应为7.2～ 7.4   。 

3.2 常用质控菌株

粪肠球菌 AT C C   2 9 2 1 2； 大肠埃希菌 A T C C   2 5 9 2 2；

金黄色葡萄球菌 A T C C   2 5 9 2 3 ； 铜绿假单胞菌 A T C C   2 7 8 5 3 。 

3.3 质控菌株的保存

短期保存 ，可用胰蛋白胨大豆琼脂斜面 ，4～8 ℃保存， 每周传代 1 次。长期保存， 可将菌株置于合适的稳定性强的保菌培养基中( 如含50 ％胎牛血清或脱纤维羊血的胰蛋白胨大豆肉汤， 亦可用含 1 0 ％ ～1 5 ％甘油的胰蛋白胨大豆肉汤) ， 保存于 -2 0 ℃或更低温度条件下 。另外，还可用真空冻干方法保存。每月至少用冷冻或冻干菌株更换一次质控菌株。 

3.4 工作悬液制备

从 T S A平皿上挑取3～5个形态相似的菌落顶端部分接种 MHB或 T S B培养基。经 3 5℃培养 4～ 6 h 后 ，用无菌生理盐水稀释至标准比浊管相同浊度 ( 0.5麦氏单位即约 1.5×1 0⁸  C F U／m L ) 。或用法国生物梅里埃A T B比浊仪比浊至 0.5麦氏单位。标准比浊管的配方：0.04 mo L／L  BaC1 ₂( 1.175 ％ W／V  BaCl ₂   2 H₂O)0.5 m L，0.7 2 mol /L H₂SO₄ 99.5m L 。0.5麦氏浊度标准管质控，应每月用分光光度计测吸光度，OD值应在0.08～ 0.1 0之间 。 

3.5 试验步骤

将药敏纸片、MH平皿从冰箱拿出，预温至室温。接种：用无菌棉拭浸取比浊好的菌液， 在管壁内轻轻转压除去过多菌液，然后再轻轻涂抹受检和对照培养基，每一平皿涂抹3次。每次涂抹后均需将平皿转动6 0度，再行下一次涂抹。目的使细菌呈融合的菌苔生长。每一质控菌 株涂抹3只平皿 。贴片： 接种后的平皿置室温片刻， 待稍干后 ，用无菌镊子将抗生素纸片均匀贴布于平皿琼脂表面。各纸片间中心间距不得 < 2 4mm ， 纸片距平皿边不得 < 1 5 min 。一旦纸片接触琼脂表面，即不可再移动，因此时药物已开始扩散。应在15 m i n内完成药敏纸片的放置。培养 ， 纸片贴妥后，在 15～ 3 0 m i n内，将平皿翻过来 置于3 5℃ 培养 1 6～1 8 h后， 观察结果。平皿培养时不宜堆放 ， 以2个相叠为宜  。观察结果，在反射光下，用精确至 1／ 1 0 mm的卡尺测量抑菌圈。MH琼脂质控参考标准见表 3 。 

表3   MH琼脂质控参考标准