《水生微生物实验法》——水生微生物的分离与纯化（3）

（三）无菌水、无菌海水和陈海水的制作

1．无菌水或无菌海水

据稀释倍数需要，以5-8 支小试管为一组，分别装入9毫升（灭菌时会蒸发成少于9 毫升，要酌情增加）蒸馏水或海水，塞好棉塞，各组用牛皮纸和纱绳包扎好．放入铁丝筐；灭菌后取出冷却备用。

2 ．陈海水

制作海洋细菌培养基或稀释海水样品时，用陈海水或人工海水，效果较好。其方法、原理如下：

（1）用玻璃瓶（而不用重金属瓶，因重金属瓶由于它们的离子易与细菌细胞蛋白质结合而使其变性，或与其酶的-SH 基结合．使它失活，故有杀菌作用，不宜采旧）取不被陆上污染的海水。

（2）使用滤孔适中的玻璃滤板过滤．弃掉其中特殊物质，以求其成分一致。若用细菌过滤器过滤．必须在滤液中加一点生海水，保证其中尚有一些细菌，以便分解过滤海水中的有机物。

（3）放置冷暗处几个星期即成（有光地方会使其中能进行、光合作用的生物生长）。几星期后，其中的杀菌成分随着时间而减少．这要比有机物的被分解、减少更重要。所用的陈海水盐度须与检查区（站）的盐度大体一致。

（四）平板和斜面培养基制备

1.斜面培养基制作

将灭菌后的装有培养基的试管，趁热将其上部垫于木棒上成适当的斜度，培养基的斜面不占至试管长的2 / 3 ，切勿使培养基沾着棉花塞，冷凝后即成斜面。制成的斜面培养基的面上以有少量凝结释出水者为佳。

 2 ．平板培养基制作

( l ）将储备培养基加热融化。

( 2 ）待冷至45 ℃ ，按无菌操作法倒入已灭菌的培养皿，每皿倒15-20毫升（约2-3 毫米厚），放在平台或桌面上，冷凝后即成平板培养基．供划线分离、涂板、鉴定、观察菌落、计数等用。

（五）营养琼脂培养基、2216E 培养基和特殊用途培养基的制备

（1）成分如下：

蛋白胨10 克

牛肉浸膏3 克

氯化钠5 克

琼脂 5-18 克

蒸馏水1000 毫升

pH7.0-7.2

( 2 ）制法：称取上述成分按次序溶解于900毫升水中，加热促进溶解，不断揽拌，直至全部溶解，加水至1000毫升．调pH ，过滤，去沉淀．分装于玻璃容器，经121℃ 蒸汽压力锅灭菌20分钟后，存于冷暗处备用。

2 ．2216E 培养基

上述培养基适用于检验淡水中的细菌总数。至于计数海洋样品中好气异养细菌培养基可用佐贝尔创造的2216E 培养基。其成分如下：

陈海水1000毫升

蛋白胨5 克

酵母膏1 克

FePO₄  0.01克

琼脂15 克

pH 7.6 -7.8

配制法同前培养基。

3 ．专用培养基制备

它们的化学成分颇多，制备步骤稍繁。如上述适用于分离大肠杆菌群及肠道病原菌的鉴定培养基—— 伊红-美蓝( E.M.B ）培养基。

( 1 ）成分如下：

蛋白胨10克

乳糖10 克

K₂HPO₄ 2 克

琼脂20克

蒸馏水l000毫升

2% 伊红水溶液20 毫升

0.5%美蓝水溶液13 毫升

( 2 ）制法如下：

① 在20 克琼脂中加蒸馏水至800 毫升。

② 加热使溶解，不断地搅拌．

③ 加磷酸氢二钾和蛋白胨，使溶解混匀。

④ 补充蒸馏水，使溶液体积达900 毫升。

⑤ 调pH 为7.2-7.4

⑥ 趁热用脱脂棉或绒布过滤，去沉淀。

⑦ 定量（100 毫升或150毫升）分装于锥形瓶内。

 ⑧ 塞好棉塞，棉塞及瓶颈用牛皮纸包好，用纱绳扎牢。

⑨ 在115 ℃ 高压蒸汽锅内灭菌20 分钟后，储于咭处备用。

⑩ 乳糖另在100 毫升蒸馏水中溶解，于112.6 ℃ 蒸汽灭菌10 分钟，以免在上述温度和压力下使乳糖受到破坏，影响实验效果。

11将上述储备培养基加热熔化，按比例加入乳糖溶液．

12据瓶内培养基容量，用无菌移液管按比例吸一定量已灭菌2%伊红水溶液及0.5 %美蓝水溶液加入已熔化的储备培养基中，充分混匀（防止产生气泡），制成平板培养基，置于冰箱备用。

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