《水生微生物实验法》——灭菌法（1）

微生物实验及生产中为了排除其他微生物的干扰获得准确结果，必须将有关物品包括实验者的双手都要灭菌或消毒．灭菌是应用物理的或化学的方法杀死或除去物品上的一切微生物或芽胞。消毒一般用化学药品把物品上的微生物营养体杀死．而不一定能把所有微生物及其芽胞都杀死。消毒与灭菌的方法很多，但可分为物理和化学法两大类。如高温灭菌，辐射灭菌、干燥灭菌，超声波杀菌，过滤除菌等皆属物理法．而用酸碱．重金属盐有机化合物、卤素及其化合物等均属于化学法．

（一）物理灭菌法

1 ．高温灭菌法

每一种微生物都有它的最适生长繁殖的温度范围．当温度超过微生物生长的最高温度时．将引起其蛋白质凝固，致死微生物，所以一定温度下可灭菌，特别是100 ℃ 以上的高温，灭菌效果更好。

( l ）干热灭菌：用干热灭菌方法有以下多种．

① 焚烧灭菌法．即将接种环和针、玻璃捧、试管口、锥形杯口、载玻片等在接种前后直接在火焰上焚烧灭菌．玻璃器皿要转动，不必烧至红。这些器具焚烧后须在火焰旁（塞回棉塞的容器除外）得冷后才能进行下一步工作，否则会致死菌种或使瓶口破裂。实验动物或废物也可直接焚烧灭菌．这种方法可靠方便，但使用范围有限。

② 干热灭菌法：它是用干燥箱（烘箱）内的热气来灭菌口操作方法如下

a. 把洗净包装好的移液管．培养皿和金属用具及某些蒸汽不能穿透的物质放在电干燥箱（电烘箱）内。

b ．打开电源使温度逐步升至140-170 ℃ ，一般为160 ℃ ，保持1-2 小时恒温，可达到灭菌目的。

c.调节开关，使温度逐步降至50-70 ℃ 方可把箱内的灭菌物品取出，否则，突然降低或是开始时突然升温，均会引起玻璃器皿破裂。此法的灭菌时间较长，原因在于蛋白质在干热条件下不易凝固（表2 一2 ）。

表2 -2 蛋白质含水景与凝固温度关系

如果灭菌物品的体积大，传热较差或物体堆积过挤，需适当延长灭菌时间。干热灭菌法的适用范围只是玻璃器皿和金属用具等耐热物品及蒸汽不能穿透的甘油和其他油类等物质。其优点是能保持灭菌物品的干燥。

（2）湿热灭菌法：干热法需较高温度，较长时间才能达到灭菌目的。而湿热灭菌法却可在较低温度、较短时间达到相同目的。从蛋白质含水量越高其凝固温度越低的关系（表2-2 ) ，就可清楚理解此法相对干热法的优点是能在较低温度下达到灭菌目的．能省燃料、省时间，因此效率高．

表2-3 蒸汽压力与蒸汽温度关系

① 蒸汽灭菌法：实验室积生产上广泛使用高压蒸汽锅。有卧式、立式和手摄式三种，它们具有密闭的外壳和内夹层，夹层及锅中可充满饱和蒸汽取代空气，故锅内与夹层内的温度可随压力的提高而增高（表2-3) ．消毒锅的致死微生物主要在于高温，同时也由于蒸汽穿透力强，所以一般采用121 ℃ 蒸汽压力下处理15-30 分钟即可达到彻底灭菌目的，是一种迅速而高效的灭菌法。对体积大、热传导性较差的物品，加热时间需延长．利用高压蒸汽锅灭菌主要是靠内部蒸汽温度升高灭菌，而不是靠升高压力，因此，若空气没排尽，压力虽然达到，而温度却达不到要求，灭菌效果将受到影响。

若锅内空气没排尽，锅内的温度达不到要求，就得延长灭菌时间，或升高压力使达到所要求温度，也需要廷长时间，这样就不能达到高效。故灭菌时应先将锅内的冷气排尽。

立式或手提式高压蒸汽消毒锅操作步骤及注意事顶：

a.打开进水阀，从漏斗加水到锅内夹层．待水位达到标志的高度时停止，关闭阀门。加到锅内夹层的水最好是煮沸过的．以减少水垢在锅内的积存。

b ．将已包装好的灭菌物品装到锅内，不能装得太挤．否则会影响蒸汽的流通、影响灭菌效果。

c ．对角地、平衡地拧紧锅盖上的螺旋，使锅盖关密，勿漏气。

d ．点燃热源（电热器、煤气灯等均可用）和关闭排气孔。

e ．当压力计至0.2 公斤／厘米²时开放排气孔，放出锅内残留的冷气．反复两次，待锅内的冷气排尽，即可关闭气孔；也可点燃热源时就开放排气孔，而后见排气口有大量蒸汽排出的现象时，就可视为锅内的冷气已排尽．此时应将排气阀关闭．锅水在沸腾升温、升压中。

f ．当锅内的温度升至121 ℃ 或压力为1 公斤/厘米²时，控制热源，使温度及压力都能稳定在这个水平上15-30 分钟。

g ．关闭热源。如果灭菌的材料体积大，或多而拥挤，使温度达不到标准时，应当延长灭菌时间后，才能关闭热源。

h ．待压力降为零时打开排气孔。不能过早地打开排气孔，以免锅内压力加速降低；但又不能同时很快地降温，而使培养基沸腾起来，沾污棉塞，甚至冲出容器，造成污染。

i ．打开灭菌锅盖，取出灭菌物品。

j ．旋开排水阀，放尽锅内剩水。

使用高压蒸汽压力锅时必须严格遵守所规定的压力，温度和灭菌时间，不然会影响实验结果的正确性。对含有乳糖作发酵鉴定用的培养基消毒灭菌压力不宜超过8 磅，时间不宜超过10 分钟。

如果使用卧式的高压蒸汽锅，一般用蒸汽作为热源，不必灌水，排水，但打开蒸汽进入阀时，必须慢慢地旋开，不北蒸气猛冲锅内。其他的操作过程基本上同立式高压蒸汽锅。

高压蒸汽锅只适用于各种耐热物品的灭菌，如普通培养基、生理盐水、淡水、海水、玻璃器皿、工作服等的灭菌。

② 煮沸消毒法：它是利用微生物营养细胞体和一部分芽胞在煮沸15 分钟后即死亡的原理而设计的。如果延长煮沸时间并在水中加1%碳酸钠或2-5%石炭酸，效果更好。此法适用于注射器、解剖用具等的消毒。

③ 间歇灭菌法：这是通过几次反复蒸煮或通过几次蒸汽处理而达到灭菌的方法。其步骤是将待灭菌的物品放在阿诺德氏（Arnold ）灭菌器或蒸锅，或蒸笼内，常压下，100℃ 处理15-30 分钟，以杀死微生物营养细胞。冷后放于28-37 ℃ 下保温24 小时，使其中残留的芽胞萌发成营养细胞，再以同样方法经三次处理就可将所有的营养细胞和芽胞杀死。此法较费时，一般仅用于不耐热药品．营养物（牛奶、维生素… … ），特殊培养基等。在缺乏高压蒸汽灭菌锅时亦可川于一般物品的消毒。

④ 巴斯德（Pas teur ）消毒法：它适用于牛乳、酒类、食醋、酱油等不能耐高温（100 ℃ ）的食品的消毒，杀死其中的病原菌，如结核杆菌、伤寒杆菌等和多数细菌的营养体，而不损害食物的营养与风味。方法是以63-66 ℃ 处理30分钟．或71℃ 处理15 分钟。

2 ．过滤除菌法

它是利用一种过滤器，如瓷过滤器、石棉过滤器或玻璃过滤器等，将血清、毒素、酶、维生素、蛋白质、糖，抗生素等，以及其他一些热不稳定的物质（如含碳酸氨钠的缓冲液，受热失去CO₂ 变成碳酸钠）过滤除去遗留在滤板上微生物，若滤板孔径不超过l 纳米，则可得无菌液。病毒能通过过滤器，所以过滤法只达到无细菌，不能达到无病毒。经过滤的水可除去90-99%的细菌。

过滤除菌要用细菌过滤器，其形式很多，主要有以下几种：

( 1 ）硅藻土过滤器（又称：Berkefeld 或Mandler滤器）固滤板部分形似蜡烛，所以又称“滤烛” , 硅藻土滤器有许多类型．它们的区别在于滤器的孔径和容积的大小。孔径可分为粗、中、细，即“V ”、“N”、“ W” 三种型号。V 型的孔径最大，小细菌可通过，W 型的孔径小于0.1 微米，N 型处于二者之间。

这些滤器标有过滤所需的压力。过滤时把待滤液注在玻璃外套滤烛之间，用过的滤烛经处理后，可多次使用。

( 2 ）蔡氏石棉板滤器（又称赛氏滤器，即Seitz滤器） ：伯克费尔德（Berkefeld）滤器易损坏，且较难过滤。蔡氏滤器较易过滤，使用简便。常用的有E , V 型，滤板孔径的大小相当手硅藻土滤器的W 型。它是金属筒制成的，分上下两节，过滤时用螺旋把石棉板紧夹在上下节间，然后将待滤液倾入滤器抽滤。每次过滤必须更换一张新的石棉滤板。石棉板滤器因其容积大小不同，而有各种型号。

( 3 ）玻璃滤器（砂芯细菌漏斗）: 它的外型是个圆筒状的玻璃漏斗．在漏斗底部有一块砂滤板与漏斗粘合在一起。反复加热灭菌和冷却，容易使滤板与漏斗壁之间出现空隙，至使滤器不能再用．滤板有多种规格，适于过滤细菌的型号有1 G5 等。上海玻璃厂生产的砂芯漏斗有1-6 号六种规格，如表2 -5 。

从上述可知，使用过滤器时，必须选好规格，否则不能达到目的．水中细菌往往比陆上的小，尤其是海洋细菌，其平均长度是2-3 微米，宽度是0.4-0.6 微米，小的洋海球菌．直径仅有0.3 微米，丝状型的海洋微生物的丝体宽度也小至0.3 微米，故用于除去海洋细菌或其他水中细菌时，过滤器的滤板孔径要选择0.3 微米以下的为佳。

表2-5 上海玻璃厂砂芯漏斗规格与用途

各种滤器在使用前后皆应彻底洗涤于净。清洗方法如下：

① 新滤器要在流水中彻底洗涤，然后放在1:1000盐酸水溶液中浸数小时，再用流水洗涤。

② 如过滤物含传染性细菌或病毒．应将滤器先浸于2%石炭酸溶液2 小时而后洗涤。

③ 硅藻土滤器在使用后应立即洗涤，从反向压入流水，冲去滤孔中大部分的物质后，浸在2%胰蛋白酶液中，放于37℃ 恒温箱内24 小时，使残余的有机物完全分解，而后用水冲洗，刷净，测验好过滤器的可靠性，干燥后下部用脱脂棉包裹插于滤液接受管上．用九层纱布包后再用牛皮纸包装，高压蒸汽灭菌后备用。

滤过后的培养基或其他溶液应放在25-30 ℃ 下3-5 天，如没有微生物长出则说明过滤器可靠性良好，滤过液无菌，可使用。

3 ．紫外线杀菌法

紫外线的波长为380-200纳米．它们都有杀菌能力，波长为260纳米左右的紫外线具有最高的杀菌效应。

紫外线对微生物有害作用是由于微生物细胞中的许多物质对紫外线吸收。核酸、嘌呤、嘧啶对紫外辐射吸收能力特别强，DNA 和RNA 的吸收峰为260纳米，蛋白质是280 纳米。紫外线致死细胞主要是对DNA 的作用，诱导胸腺嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制，轻则产生突变，重则致死。

（1）应用范围：紫外线是一种强的杀菌剂．在无菌操作中（如无菌室、接种箱、桌椅及其他用具）和卫生医疗中广泛地被应用。但透过物质的能力很差，不易透过不透明物质．即使只隔一层薄玻璃也会被滤去大部分。所以紫外线只适用于空气及物体表面的杀菌。

（2）杀菌方法：对无菌室消毒的时间，视其空间大小和所装的紫外线杀菌灯的瓦数多少而定一般开灯20-50分钟．为加强紫外线的杀菌效果，在开紫外线灯前，接种室或接种箱可用5%酚水溶液喷洒，使空中的微生物，尘埃降落，杀死一部分营养体和芽孢。无菌室内的桌椅面，可用2-3%来苏尔擦洗。

（3）杀菌效果检验：在灭菌后的室内打开营养琼脂或豆芽汁琼脂平板培养基5-10 分钟后，盖好，置37 ℃ 恒温箱中培养1-2 天，如果只有一、二个菌落，可视为效果良好，如果杂菌丛生，则应延长紫外灭菌灯的照射时间或加强其他措施。

在采用物理方法灭菌消毒中，还可应用20 万周／秒以上的超声波使微生物细胞破碎致死，也可应用我国试验成功的静电除菌法代替过法装置去除空气中杂菌等．

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