《水生微生物实验法》——分离与纯化（1）

分离与纯化培养

（一）器具及设备

1 ．试管

微生物分离主要是在斜面培养基上进行，利用普通化学所用的试管即可，但管壁要厚的好，太薄的，在塞棉塞时易破裂。有的试管配有塑料盖或铝盖，用于需要进行封管培养的，更方便。

2 ．培养皿

在分离微生物中，培养皿是用于平板培养．最好是用直径为9 厘米左右的培养皿。一般是玻璃制成的．七十年代以来国外已有出售灭过菌的塑料培养皿．在一次需要大量培养皿时（如出海调查时）很方便。但这种培养皿用后，若再用高压蒸汽灭菌等，会缩小而且易固结，所以用后可废弃。

3 ，接种环和接种针

这是微生物接种时的主要用具，在分离中主要用于挑取培养物或样品、在平板培养基上划线及挑取平板上的菌落接种于斜面培养基上。实验用的接种针，一般为4-5 厘米长镍铬合金丝制成，可分为环、耳、线和钩四种。如果用白金制成的称白金耳、白金线、白金钩和盘绕接种环。白金耳顶上的圆环的直径以2 毫米左右为准。所谓一环的接种量，就是表示接种的大致菌量．所以接种环不宜做得过大或过小。接种针或钩是用于挑取细小菌落接种分离，接种针则用于穿刺培养。白金制成的接种针或环的优点是性质稳定。对微生物无毒否作用，加热后能迅速冷却，也不会因为接触培养基中的化学药品而遭损坏．但白金价格昂贵．

4 ．玻璃刮刀

它是用直径为3-4 毫米的玻璃棒弯曲成三角形而成的。使用时，应使它与培养基平面成30-60^。角将滴加在琼指平板上的样品涂布均匀，使其长成单个菌落．作分离或培养计数．观察菌落形态之用。使用前必须用牛皮纸或铝箔之类包上进行干热或湿热灭菌，如果是供计数用的，则涂布一个平板须用一支刮刀，若用同一刮刀时应在火焰上灭菌，持于火焰边待冷后再涂布第二个平板。

5 .转台

旋转涂布台是将培养皿放在旋转台上，开动马达使其旋转，用刮刀接触琼脂平面．则样品很快地被涂布均匀，故使用这种装置作平板涂布分散样品的操作非常方便，可提高工作效率。

6 ．酒精灯或煤气喷灯

这两种灯的火焰使其周围的微生物的烧死，热死，在一定空间造成相对性的无菌场，便利无菌操作。同时可用火焰烧死粘于接种环或针、试管口、瓶口等的微生物，以免感染杂菌。一般，火焰大些好。因此分离接种都得在火焰旁进行操作。

7 ．接种箱或超净工作台

分离微生物时，如果不是在无菌室进行，必须配备接种箱。接种箱在分离接种微生物前必须用化学药物消毒，或使用箱顶上的紫外灯预先灭菌口超净工作台是利用鼓风机将空气经过滤装置滤去微生物后从工作台面吹出．工作台使用前须先用70%酒精或其他化学药物消毒擦净。在使用接种箱及超净工作台时，能同时用酒精灯或煤气灯，就能更好地保证不染菌。超净工作台使用前需先开动一定时间使原来在工作台内部的微生物吹出工作台以外，才能造成工作台上无菌。

8 ．其他

分离微生物时．除了上述器具设备外，还需要试管架或金属丝篮．一次可装大量的试管，用起来方便；棉塞，分离好氧或兼性好氧菌时使用；试管盖，有铝制品，也有塑料制品；石蜡，用于分离培养厌氧菌，封固试管或厌氧装置，防止空气进入；还有稀释样品用的移液管、烧杯、三角瓶，玻棒，量筒、台称、镊子、毛细管、显微镜、载玻片、显微操纵器、超滤膜装置等等。

 

（二）十倍稀释分离法

在河泥、池泥、海泥和含有机物较丰富的河水、池水、污沟水，水库水、近岸海水、港湾水、河口水中的微生物数量及种类，都相当多，要分离出其中某种微生物，必须用无菌水或无菌海水将水样或泥样稀释，加吐温80，使微生物成单细胞地分散于水中，制成具有一定稀释度的微生物悬浮液，而后取一定量的悬浮液接种分离于平板培养基上，培养形成单菌落，进而挑选菌落作纯培养．若样品是附着的．则应先将附着物刮于无菌水或无菌海水中，而后稀释分散… … 。但有的样品并不是直接来源于上述的自然界，而是从保藏的斜面生长物取得，也可先将斜面上的菌台刮下，稀释分散，照样取悬浮液接种，分离、传代、复壮等，上述的稀释分散的分离法正与本节（六）将谈及的，与从含有机物稀薄的远洋水、泉水和深层贫质的沉积物中．应用超滤膜分离微生物的浓集方法相反。

常用的稀释法有十倍稀释法等，此法常用于细菌平板计数法、液体分离培养法和液体培养计数法等，因此，它是微生物实验、研究工作的基本方法之一，具体操作步骤如下：

（1）用无菌刀刮开底泥（或其他沉积物）样品的表面，称取中央的样品10 克（或吸水样10毫升），于火焰边打开装90毫升无菌海水（用于咸水样品）或无菌水（用于淡水样品）的锥形瓶棉塞，（瓶口于火焰上烧儿转，立即放入样品，塞好棉塞，振荡混均，即冲稀10 倍，以下各步骤应始终在火焰边操作。

（2）静放1-2 分钟后，弃沉淀物（即将上清液倒入另一无菌瓶）。

（3）左手拿锥形瓶，右手无名指，小指和手掌拔出棉塞，靠手腕动作，将瓶口在火焰上旋转灼烧几圈，以此灭菌．拇指、食指、中指抓无菌移液管在火焰上通过l-2 次，吸取经摇匀清液l 毫升（如果原样品属于水样，吸后需吹回，反复数次，混匀后应立即再吸l 毫升）于9 毫升的无菌海水或无海水试管中。此管编号为2 ，再灼烧试管口或烧瓶口，塞紧棉塞，即稀释100倍。

注意不能用容器口去迎棉塞。移液管插回原纸套卷中。

（4）取另一支无菌移液管，重复前个步骤．冲稀成10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸等倍，其浓度则为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8

视样品中所含的微生物数数量而决定冲稀倍数的多寡。一般可根据样品含有机质的丰富程度及实验目的作估计 ，若是近岸海水或轻度污染的港湾水、河口水，一般冲稀至10^-9-10^-7即可，而污染较严重的河口水或港湾水则须冲稀至10⁸倍以上，才能适含于水样中的细菌稀释计数。如果是应用于平板计数细菌．则冲稀至每个平皿培养基上长出30-300 个菌落为合适。