《水生微生物实验法》——分离与纯化（2）

（三）平板划线法

划线的方法很多 ，此法主要是用接种环挑取菌液或菌苔，或者用动植物体表小块直接在平板培养基上划线使上面的微生物逐渐分散于培养基上，达到单细胞分散而长出纯菌落。此法少骤如下：

（1）取环样品悬液，或少许菌苔或小块生物体表或者内脏残余物在表面无冷凝水的平板培养基一侧反复涂片约1厘米宽带。

（2）灼烧接种环，将接种环接触培养基边缘使之冷却后．使接种环与平板培养基轻轻接触与平板成30度角左右．从涂菌处在一侧划出2-3 条平行线．不通过涂处再划2-3 条线，靠近前2-3 条的平行线，划线时不使接种环接触培养皿，不要划破表面，伸到培养基内。

（3）灼烧接种环，然后通过原划线划出与之成70-80°角2-3 条平行线，连续划2-3 条不通过原划线的平行线。

（4）按此法反复划几组平行线，直到划满平板为止．

 （5）倒放平板于20-30℃下培养至长出明显的菌落为止。若得不到由单细胞长出的纯菌落，可再挑取长出的菌落，重复此法再划线分离，最后挑取纯种接种于斜面培养基上。

（四）倒平板法和平板涂布法

1 ．倒平板法

（1）按前面无菌操作法吸取已摇匀的适当浓度稀释液1 毫升或0.1 毫升，用左手拇指和食指夹住无菌培养皿盖，其他三个手指和手掌托住培养皿盖底（预先贴明稀释度标签），用拇指和食指撑开培养皿盖。注意开口不能太大，否则易染菌，并必须在火焰边，开口不能对着鼻孔，以免呼吸时将杂菌吹入培养皿内．伸进移液管．注入稀释液，。随后关下培养皿盖．

（2）右手取己融化冷至45 ℃ （温度过高会使接种物烫死，温度低培养基将凝固）的适宜的培养基管，左手拔出棉塞，在火焰上灼烧试管口，旋转几次。但不可烧得太热，否则当培养基倒出时管口破裂。左手拿已注有稀释浓的培养皿，用食指和拇指在火焰边同前步骤稍撑开培养皿盖。用右手把试管中培养基倾入。立即将培养皿盖好，放在桌上旋转几次，使接种物均匀地分布在培养基中．冷凝后倒放。重复此步骤，视需要再接种几个稀释度，利于长成单个菌落。如果每个稀释度接种两份，也可应用于计数。注意吸稀释液时，如果没换新的移液管，必需用相同稀释度的移液管．

（3）倒放平板，于适温下培养。由于这种方法是先注入样品，而后倒45 ℃ 培养基。由实验结果证明这种温度能伤害水生微生物，故用平板徐布法效果较好．

2 ．平板涂布法

（1）用右手拿移液管，照无菌操作法吸取一定浓度稀释液0.01 -0.1毫升。左手拿贴有相应稀释度标签的，装有选择性培养基的培养皿．用拇指及食指稍撑开皿盖（开口不宜太大．并不能对着鼻孔），在火旁注入移液管中的稀释液

（2）放下移液管，取玻璃刮刀在火焰上灼烧灭菌后．于火焰旁在皿边接触无接种物的培养基，以加速玻璃刮刀冷却，但不能把培养基烫溶化或刮破．随后将接种物在培养基上涂布均匀（如果有旋转涂布台，将平板培养基置于台上涂布．较快速而均匀）．不可将培养基涂破，盖好培养皿。

（3）重复上述步骤，视实验要求再接种几个不同浓度，以便形成单个菌落。便于挑选分离．如果每种浓度接种两个平板培养基，可应用于计数。

（4）将接种后的培养皿倒置．于适温下培养，观察，要注意当水中含总菌数，或所需的分离菌数量少时，需增加接种水样的数量。不宜用涂布法。

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