《水生微生物实验法》——分离与纯化（3）

（五）单细胞分离法

为了纯化、确保一个菌株是由一个细胞发育而来的，需要进行单细胞分离，作为稀释平板分离的悬液，如果是经过充分分散，并稀释到合适稀释度下，再经过脱脂棉过滤．那么在平板上长出的菌落，基本上是由单细胞形成的。较为可靠的单细胞分离法是：毛细管分离法、小滴分离法和显微操作器法。

1 ．毛细管分离的两种方法

能产生体积较大，颜色较深的一些霉菌的分离，可采用毛细管分离法。此法较简便，其分离步骤如下：

（1）将玻璃管烧熔抽成毛细管，长度为5 厘米和20厘米两种，置于160 ℃ 下干热灭菌．

（2）将欲分离纯化的样品，用熔化后凉至45℃ 琼脂培养基管制成悬液，保持于45℃ 水浴中。

（3）将载玻片在酒精火焰上灭菌，凉后置于显微境载物台上。

（4）取毛细管吸悬液放于载玻片上．用低倍镜检查，当找到单个分生孢子，而且距离左右两侧的分生孢子较远时，用无菌镊子将此段毛细管折断。

（5）用酒精消毒含有单个分生孢子毛细管， 然后将其检出放入斜面培养基上培养。

（6）分生孢子萌发并形成菌落后，检查其纯度。

第二种方法的步骤如下：

（1）将拉成的毛细管的一端弯成直角．经酒精消毒后．粘于显微镜的聚光透镜上，使弯日转上。将集光器旋下，使毛细管尖端位于通光孔的正下方。

（2）将欲分离的孢子用无菌水制成适宜稀释度的悬浮液，滴1 滴于灭菌的载玻片上，反转放在载物台中央，使水滴位于通光孔中央，成悬滴．

（3）用低倍镜寻找悬滴中的单个孢子．旋上集光器，逐渐在视野中见到毛细管口．移动玻片使毛细管口对准单个孢子，再旋上集光器使管口接触孢子。由于毛细管作用，孢子被吸入毛细管内．

（4）取下毛细管，将管内水滴移于新鲜平板培养基上培养，待长成菌落后检查其纯度。

2 ．小滴分离法

（1）将无菌吸管顶端经火焰烧熔拉成毛细管，

（2）将要分离的样品制成适宜稀释度的悬浮液。

（3）以毛细管吸悬液于无菌盖玻片上．纵横排成行，每数小滴。

（4）倒置盖玻片于凹形载玻片上，或倒置于有玻璃圈或火柴杆作支架的载玻片上．

（4）镜检发现某小滴中只含单细胞或单个孢子时，用另一无菌毛细吸管将此液滴内的单细胞移到新鲜平板培养基上培养。

3．显微操纵器的分离法

显微操纵器是一种与显微镜相联合的装置。此种仪器上所装的微针，在显微镜的视野可以对细胞或组织进行解剖、移动或作其他处理，故能从视野内运用此器械挑取单细胞或单个孢子，并转移到无菌培养基内。采用此法的优点是能确证所得的培养物是由单细胞发育而成的。缺点是要具备昂贵的设备和热练的技术，操作时较慢．染杂菌的机会多．

操作步骤，

① 湿室与分离面的准备分离操作前应在小室内四角各放一团湿棉花，以保证小室内的适宜湿度。在洁净的盖片上均匀地涂一层灭菌的油脂（50%凡士林和50%石蜡混合物）盖于小室的小孔上，使油脂面向下作为分离面．待小室内湿度达到饱和时（约经10 分钟）开始操作。

② 毛细管与操纵器的准备；

a ．将显微镜的聚光器聚焦于盖玻片上，把操纵器向两侧拉开。

b ．应用毛细管作用吸进菌液到毛细管内．而后将其固定在右侧操纵器上。

c ．慢慢推动操纵器，将其头部（微针）送进小室侧孔，使吸管切口向上．

d ．在吸管尾端约5 厘米处用夹子夹住．

e ．在左侧操纵器上固定吸有液体培养基的长约5 厘米的毛细管，同样将其头部伸进小室的另一侧孔，也使切口向上．两根管不能互相接触．以免污染左侧管。

③ 菌液稀释度的镜检，转动右侧操纵器螺旋，使毛细管口与分离面接触，轻轻挤压橡皮管，使菌掖在分离面形成一微滴，大小不能超过高倍镜视野．迅速转动调节器使操纵器降低，而毛细管离开分离面，以免菌液重新回到管内。观察液滴，若其中仅有0-2 个需分离的菌细胞，则此菌液的稀释度适用。

④ 菌液吸取及接种，如菌液滴的菌数合适时（最好为1 个细胞），在低倍镜下把左侧的毛细吸管移到掖滴下。在高倍镜下证实管口对准菌液后，抬高左操纵器．使管口与液滴接触，并将其吸入管内，然后使管口脱离分离面，用高倍镜证实液滴中菌细胞确实吸入管内后，取出毛细吸管，将其中菌细胞挤出接种于培养基中，则可培养出单细胞长成的菌落。

操作注意事项；

① 毛细吸管口必须圆整光滑。

② 湿室湿度要适当．可用两侧孔开闭程度调节。

③ 盖玻片油脂要均匀。

④ 菌液稀释度必须适宜，使分离面上液滴内，多数只含1个细胞。

（六）超建膜分离法

在远洋海水、矿泉水、瓶装啤酒等当中，细菌的浓度常常很稀薄（10²-10³ 个细胞／升．或更少）．为了进行有效的分离或定量地计数菌数，必须将一定量样品通过超膜过滤。使细菌浓缩粘附于膜上，而后进行培养分离或计数。

1 .超滤膜滤器

由玻璃制成，分上下两部分：上部为其有刻度的圆筒，筒上有盖；下部为碗状漏牛：碗口中央嵌着一块3 号砂芯滤板。滤膜被夹在滤器上下两部分之间．滤器上下部的两侧各有彼此对称的挂钩。由于挂钩上的弹簧或橡皮圈的拉力，使上下两部紧闭不漏水．根据用途不同超滤膜滤器需备有大小两种，大的口径30 毫米，小的口径10毫米。

2 ．超滤膜

以硝化纤维为主要原料制成的白色薄膜，其规格如下：孔径平均为0.3 微米的一号滤膜，其中最大孔径不能超过0.5 微米．厚度为0.1 ±0.02毫米。直径为15 和35 毫米的两种。韧性．达到对折不断的要求。

3 ．分离步骤

（1）超滤膜在使用前应先经灭菌处理．取自径为35 毫米的超滤膜数张，放入装有150-200 毫升蒸馏水的300 毫升的烧杯中，加热煮沸15-20分钟．直到蒸汽中无丙酮气味为止。

（2）使用无菌的镊子取出超滤膜，仔细地装于超滤膜器上．装过滤器于抽滤瓶上，并通过三通活塞与真空泵连接，三通另一余端塞上少量棉花，直通大气

（3）以无菌移液管吸取10.0-30.0毫升水样放入滤器．

（4）开动真空抽象泵抽滤．使水样中的微生物浓缩在滤膜上，操作时须注意过滤速度，太快，可能使滤膜破损，需重作。当抽滤到滤膜上的最后一滴水恰好滴下时，应立即转动三通活塞，停止抽滤。

（5）打开滤器，用无菌镊子轻轻取下滤膜使过滤面向上，放于无菌的小培养皿的滤纸（先经选择性培养基浸透、烘干、灭菌，使用前用无菌水湿润）上，或者放在平面培养基上。此时应使滤膜和滤纸或培养基之间互相紧贴，无气泡、盖好培养皿，写明日期、编号，并将小培养皿放于铺有用水浸透了脱脂棉的大培养皿（直径15 厘米）中。盖好大培养皿，借以保持皿内的湿度。用不同量的水样重复上述步骤，以便长出单独易挑选的菌落．

( 6 ）在18-20 ℃ 下培养4-7 天，待长出明显菌落时，挑选典型菌落，接种于合适的斜面培养基上，或直接在适宜的平面培养基上划线再分离，直到菌落形态一致，供鉴定用．膜上长出的菌落也可供计算用，取平均值。

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