《水生微生物实验法》——不同类型微生物的分离方法（3）

（三）海洋发光细菌的分离培养

发光细菌所发的光是冷光，在转变化学能为光能中。效率接近百分百．所以发光细菌是研究光源材料之一，细菌灯可作为危险品仓库的照明，在细菌发光时绝对需要氧气，故可应用于低浓度氧的测定，发光细菌也可用于毒物和抗菌素的测定，将来还可能用于宇宙航行时对地球外的生命物质的探测。海洋发光细菌既可从鱼的体表、内脏，发光器官分离而得，也可从海水或河口水及其沉积物中分离得到。发光细菌在新鲜的海洋鱼类体表多于腐败的鱼体。鱼体一旦腐败，腐生菌繁殖很快．并且取代发光细菌。故分离发光细菌时要用新鲜鱼或其他新鲜海洋动物。典型的发光细菌是筒状细菌，大小约1.1×42.2微米，也有球状和弧状，又分单极鞭毛和周生鞭毛，多数为革兰氏阴性菌．我国已分离的发光细菌目前有四种。

1 ．增殖培养

（1）取一条新鲜鱼，放在无菌的大培养皿内，向鱼体上倒入无菌的3 %食盐水，使液面高度在鱼体腹线处．不可将鱼体完全淹没。将鱼的内脏拉出用无菌剪刀剪开胃肠．取出内含物放于无菌培养皿中，同样加入无菌的3%食盐水．不淹没鱼内脏，浸入二分之一即可。

（2）置于15 ℃ 温箱中培养l-2 天后，在微暗处观察。鱼体表面微弱的亮点便是发光细菌，则应及时挑出分离，否则腐生菌滋长，而发光菌就会消失。

2 ．第一次分离

（1）鸡蛋培养基的制备，将一个鸡蛋的蛋白及蛋黄全部倒入烧杯中，加入3%食盐水100 毫升，搅匀，分装于培养皿中；每个培养皿约倒15-20毫升，在121 ℃ 的蒸汽下灭菌30 分钟。

（2）在黑暗处用接种环分别从鱼体表面和鱼内脏内含物上的亮点处挑取少许亮度较大的发光细菌菌落。在鸡蛋培养基上划线分离，挑取亮度较弱的菌落分别在另两个鸡蛋培养基上划线。

（3）在15 ℃ 温箱中培养1-2 天，则可在培养基表面看到发光细菌的菌落。此时发光细菌菌落中发光细菌己占优势，但还混有许多腐生纽菌。若不及时分离纯化．由于腐生细菌的大量繁殖会抑制发光细菌生长。最后，将取而代之。

3.第二次分离

（1）蛋白胨牛肉膏的制备；

蛋白胨1 克

牛肉膏l 克

K₂HPO₄   0.1 克

MgSO₄·7H₂O  5 克

NaCl   3 克

琼脂1.5-2.0克

将以上物质加蒸馏水至100 毫升，混匀，加热溶解，调pH7.4 ，于121 ℃ 蒸汽压下灭菌30 分钟。冷至45 ℃ 后分装培养皿上，制成平板培养基．

（2）在黑暗处分别挑选培养基上发光细菌菌落少许，在平板培养基上划线分离。

（3）在15℃ 温箱中培养1-2 天，则可看到单个的发光细菌菌落。

（4）挑取各种菌落少许分别涂片，各用革兰氏染色法和鞭毛染色法染色，观察其菌落形态。

（5）若形态一致可视为纯种．选亮度较强的．不同形态的菌落移种于斜面培养基上．在15℃ 下培养1-2 天保存，供其他研究．若不是纯种应继续作划线分离培养，直到纯化。

（6）将纯的发光细菌接种到蛋白胨液体培养基中，在15℃ 温室内振荡培养l-2 天，便可得到大量发光细菌的悬液。（若在300 毫升锥形瓶内有100 毫升发光细菌的悬液，发光细菌的亮度在暗处足以照清一般报纸上的字迹．

4 ．其他分离法培养基

（1）甘油碳酸钙培养基：甘油1.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨2.0%、NaCl 3.0%，CaCO₃0.5%，pH6.9 .

（2）酵母膏蛋白胨培养基．酵母膏0.3%，蛋白胨0.5%，NaCl3.0%，pH6 .9

（3）蛋白胨天冬酰胺培养基：蛋白胨1.0%、天冬酰胺0.5%，NaCl 3.0%、K2HPO4 0.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH6.9 .

（4）蛋白胨酵母膏甘油培养基：

蛋白胨5 克

酵母膏1 克

甘油3 毫升

琼脂15 克

人工海水1000毫升

曾用厦门港湾水1 毫升注入无菌培养皿，倒入冷至45 ℃ 的此种蛋白胨酵母膏甘油培养基．摇匀后，置于室温（24 ℃ 左右）下培养1 天以上可分离到发光细菌，重复性良好。另将此培养基制成平板，用鲜鱼的内脏或腮直接在上面划线也都能分离到发光细菌。

注：人工海水：NaCl  20.0克、MgCl₂· 6H₂O  7.2 克、MgSO₄·7H₂O  3.6 克CaCl₂·H2O 0.7克，蒸馏水1000 毫升．

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