《水生微生物实验法》——不同类型微生物的分离方法（8）

（八）脱硫弧菌的富集、分离，纯化培养

脱硫弧菌属的分布相当广泛，在海水和污水中，特别是海泥浆、污泥中都很常见。脱硫脱硫弧菌是一种严格的厌氧菌，具有还原硫酸盐能力。

1 ．培养基的成分及制备

（1）巴尔斯氏（Baars ）培养基：

K2HPO4   0.5克

NH4Cl     1.0克

CaSO₄ 1.0 克

MgSO₄· 7H₂O   2.0克

70%乳酸钠溶液5 毫升

陈海水或自来水1000毫升

将以上盐类溶解于水，调pH 为7.0-7.5 121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟．

另配1%的FeSO₄·（NH₄ )₂SO₄· 6H₂O 的溶液，蒸1 小时，连续蒸3 次，每天1 次。临用前在每100毫升上述培养基内加入5 毫升的上清液。

此培养基有很多沉淀，不过对于粗放的培养是适宜的。

( 2 ）斯塔基氏（Starkey ）培养基：

K2HPO4   0.5 克

NH4Cl    1.0克

Na2SO4    1.0克

CaCl2·2H2O   0.1克

MgSO₄· 7H2O     2.0 克

70%的乳酸钠溶液   5.0 毫升

陈海水或蒸馏水1000 毫升

溶解上面成分，调pH 到7.0-7.5之间，121 ℃ 蒸汽下灭菌20分钟。

此培养基有少许沉淀，可在灭菌后过滤弃废，然后再灭菌。

另配l%硫酸亚铁铵FeSO₄·（NH₄ )₂SO₄· 6H₂O的溶液，临用前，每100 毫升的培养基内加5 毫升。

2.脱硫弧菌的富集培养

① 先配制20-30%的亚硫酸钠溶液，过滤灭菌，当需要时，在每100 毫升培养基中加10 毫升，用无菌的1N 氢氧化钠溶液调pH 为7.2 （每100 毫升巴尔斯氏培养基内约加2 毫升1N 氢氧化钠溶液）,

② 取2 个30-50 毫升的带塞瓶．加1-2 克接种物（污水泥或海泥）于瓶中，在瓶内加满培养基，上塞，于30-50 ℃ 下培养。

（3）如有黑色的沉淀出现，即为还原硫酸盐细菌的生长活动，形成黑色的硫化铁。如果培养数天至几个星期后．有此现象产生可进行下一步的分离培养。若无，则将样品按10%比例接种于新鲜的培养基中。

 3 ．脱硫弧菌的分离培养

（1）分离培养基的准备在斯塔基氏培养基内加入2%琼脂．过滤，灭菌．加亚铁盐无菌分装，每个试管加9 毫升，保持在45-50℃ 的水浴中．

（2）在每管培养基内加无菌的30%亚硫酸钠溶液l 毫升和已灭菌的1N NaOH 0.2 毫升。

（3）将经富集培养的培养物用上述液体培养基在无氧条件下按10 倍稀释法稀释几个梯度，每9 毫升的液体培养基可预先加入l000ppm 的无菌巯基乙酸1 毫升。

若不用液体培养基稀释．应吸取较高稀释度菌液1 毫升滴入有上述培养基的试管中，混匀后静置。

（4）将接种后的试管培养到在较高稀释度的管内出现充分分开的黑菌落为止．

另法：在无氧条件下，将富集的培养液分别接种于上述含有亚硫酸盐和不含亚硫酸盐的两种平板培养基上．接种后立即将平板密封于厌氧培养缸内。

4 ．脱硫弧菌的纯化培养

( 1 ）波斯特盖特氏（Postgate ）改进的培养基的成分及配制：

K₂HPO₄   0.5克

NH₄Cl    1.0克

NaSO₄    1.0克

CaCl₂· 6H₂O  0.1克

MgSO₄· 7H₂O   2.0克

70%的乳酸钠溶液3.5 毫升

酵母膏   l.0 克

FeSO₄·7H₂O  0.002 克

陈海水或蒸馏水1000毫升

溶解以上成分，调pH 为7.5 ，滤去沉淀．分装，在121 ℃ 蒸汽下灭菌20分钟。

（2）另用蒸馏水配0.6%盐酸半胱氨酸溶液，pH 为1.8 , 121 ℃ 蒸汽下灭菌20 分钟。临用前按10%比例加入培养基中，半胱氨酸最高浓度为5 微克分子／毫升．

（3）接种挑出经镜检形态正确的黑色菌落放于液体培养基中，在好氧条件下培养．

如果是所需菌，可将培养物转移到相同成分的平板培养基上，在1 大气压的氢气和5%的CO₂厌氧缸内培养，并把一包浸透醋酸铅的干脱脂棉放于培养物和他化剂之间。

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