《水生微生物实验法》——水中志贺氏菌的检验和分离

志贺氏菌是一种引起痢疾病的痢疾杆菌，由日本细胞学家志贺首先发现的，故将这一属的细菌称为志贺氏菌属。根据生化反应、抗原的不同可分成四类：

① 志贺氏痢疾杆菌和斯米茨氏痢疾杆菌

② 弗氏痢疾杆菌

③ 博伊德民（Boyd ）痢疾杆菌。

④ 宋耐（Sonnei ）痢疾杆菌。

1 ．培养基成分及制备

（1） G . N ．增菌液：

胰蛋白胨20 克

葡萄糖1 克

甘露醇2 克

枸橼酸钠5 克

去氧胆酸钠0.5 克

K₂HPO₄  4 克

KH₂PO₄   1.5 克

NaCl  5 克

蒸馏水1000 毫升

pH 7.0

将上述各物溶于水中，加热使溶解，校正pH 过滤，分装于试管，每管5 毫升。在115℃ 下蒸汽灭菌20 分钟．保存于冰箱待用。

（2）沙门氏，志贺氏菌属琼脂基（简称S .S ．琼脂）:

膘蛋白胨5 克

乳糖10 克

胆盐8.5-10 克

枸橼酸钠8.5-13克

Na₂S₂O₃·5H₂O   8.5-10克

枸橼酸铁0.5克

牛肉膏5 克

琼脂17-20克

0.5%中性红水溶液4.5毫升

0.1%煌绿溶液0.33毫升

蒸馏水1000毫升

将除中性红和煌绿溶液外的其他成分煮沸溶解，调pH 为7.1 ，加入中性红和煌绿充分摇匀，再煮沸l-2 次，用牛皮纸包好瓶门。冷至55℃ 左右，倾注于灭菌平皿成平板培养基．存于暗处备用。注意事项如下：

① 此培养基切忌高压灭菌，或加热的时间过长。

② 配成平板培养基后．在接种前应先使培养基表面干燥，便于分离接种．一般的方法是倒放于培养箱l 小时左右，当日使用．

③ 此培养基质量的优劣主要是与胆盐有关。要获得比较满意的结果．每批胆盐购到后，选择若干菌株，于实验室内用S.S琼脂作对照试验。必要时可适当调节盐类和胆盐的用量。要求达到：

a ．沙门氏菌属和志贺氏菌属均能生长，并保持在S.S琼脂上应有的特征。

b ．对大肠杆菌有一定的抑制能力．生长的大肠杆菌呈桃红色。

c．无胆酸扩散沉淀现象。

④ 煌绿溶液配制后，应在10 天内使用，过久不宜使用。

( 3 ）双糖铁琼脂．

上层成分：血消化汤500 毫升

琼脂6.5克

Na₂S₂O₃·5H₂O   0.1克

FeSO₄(NH₄)₂SO₄·6H₂O   0.1克

乳糖5克

0.4%酚红溶液2.5 毫升

下层成分：血消化汤500 毫升

琼脂2 克

葡萄糖1 克

0.4%酚红溶液2.5毫升

制法如下：

上层：

① 将血消化汤和琼脂混合，加热溶解，调pH 为7.8-8.0，用3-4 层的纱布过滤。

② 加入其他成分摇匀，使其溶解，装入烧瓶中。

③ 在115℃蒸汽下灭菌10 分钟．取出，立即放于56℃ 的水浴内，待用。

下层：

① 与② 同上层的① 与② 步骤，但分装试管中，每管2 毫升。

③ 在115℃蒸汽灭菌15分钟后，让其直立凝固。

凝固后．按无菌操作将上层培养基乘热装于下层培养基上面，每管约装1.5毫升．制成斜面，待用.

2 ．滤膜浓集

一般情况下，水中的志贺氏菌的数量不多，不容易检验分离出来，必须先通过浓集、增菌培养阶段，而后再进行分离鉴别．

滤膜浓集法．适于澄清的水样．取一定量的水样。按分离基本技术中的超滤膜法进行。

3 ．增菌培养

将滤膜的全部或部分放入G . N ．增菌培养基，在37℃下培养，培养时间不得超过24 小时。因培养的时间长了，会使绿脓杆菌、变形杆菌等非致病性细菌过度增长。

4 ．平板鉴别培养

用少量的增菌液在S.S平板培养基上涂布均匀，于37℃下培养24 小时。沙门氏菌与志贺氏菌因不发酵乳糖而菌落不着色，呈半透明，如有大肠杆菌群细菌生长，则菌落呈红色。某些变形杆菌与沙门氏菌的菌落中心也可呈黑色。

5 ．双糖铁斜面培养

挑选上述可疑菌落接种于双糖铁培养基，在37℃ 下培养18-24 小时，由于大肠杆菌群在此种培养基上仅仅受抑制而不长，并没有被杀死。故挑取菌落时应仅挑其中心部分，否则四周的杂菌也可能一并被挑入，影响下一步鉴定工作的顺利进行，也影响鉴定效果的正确性。

志贺氏菌的菌落和沙门氏菌相似，无色、半透明、边缘整齐，但较小和较为透明些，且更扁平。宋氏志贺氏菌的菌落较大，边缘较不整齐，且因迟缓发酵乳糖，在S.S．琼脂平板上的菌落有时呈玫瑰红色．所以供生化鉴定的菌落应多挑几个以防遗漏．

6 ．一般的生化鉴定

经双糖铁斜面培养，如果在底层葡萄糖产酸不产气，无动力，不产生硫化氢，上层斜面乳糖不分解，则可视为可疑的志贺氏菌，可进行生化和血清学检验。

生化检验项目包括：葡萄糖、甘露醇，麦芽糖、乳糖、蔗糖、靛基质、硫化氢、动力、尿素。志贺氏菌属能分解葡萄糖、但不产气（弗氏志贺氏菌b 型有时能产生少量气体）; 一般不分解乳糖及蔗糖（宋氏志贺氏菌对乳糖及蔗糖迟缓发酵产酸）；志贺氏菌均不产生硫化氢．不分解尿素，无动力，对甘露醇、麦芽糖的发酵及吲哚的产生，则因菌株不同而异。在37℃培养后无动力者，必要时，放室温观察4-5 天．

如遇多价血清玻片凝集试验为阴性，而生化反应符合上述情况时，可加做肌酵、水杨苷、V . P ．、枸橼酸盐、氰化钾等试验，志贺氏菌属均为阴性反应。吲哚产生阳性的无动力菌株．可加做5 %乳糖发酵管和葡萄糖铵试验，志贺菌属均为阴性。

7 ．系统生化检验

表2-7 志贺氏菌属的系统生化检验

注．十90 %以上阳性；-90%以上阴性；( + ）迟缓阳性；d 有不同生化型．十/-多数阳性：-/+多数阴性．少数迟缓阳性．

志贺氏菌属的生化反应和抗原特性，有时产生变异．故必要时，按系统的生化特性作鉴定，凡符合表2-7 的菌株可鉴定为志贺氏菌属。如果在水样中检验到志贺氏菌，则该水质已受污染．视单位水样中的志贺氏菌数量，可确定受病原菌污染的程度。

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