《水生微生物实验法》——水中粪链球菌群的增菌培养与分离

粪链球菌是肠道链球菌类的一个菌群、与食物中毒有关，属人类致病菌。常存于人与动物所排出的粪便及生活用水中，如海水游泳场、淡水游泳池和一般粪便污染的水源及饮用水都有可能检查到粪链球菌，链球菌的菌落较小（直径约0.5毫米）、圆形、突起、灰白色、半透明或不透明、表面光滑、有乳光。不同菌株的菌落周围有不同变化．

1 ．增菌培养

增菌培养基成分及制备．匹克增菌液：

1 ％胰蛋白胨的心肌浸液200毫升

1 : 25000结晶紫盐水溶液10 毫升

1 ：800三氮化钠溶液10 毫升

脱纤维兔血（或羊血）10 毫升

将上列已灭菌的各成分，无菌地依次混和均匀，分装于试管、每管2 毫升，保存冰箱备用。

2 ．接种培养

（1）如果污染较严重的水样，可直接把样品接种于匹克增菌液中，若污染较轻度需要采用滤膜法先将细菌浓集，而后放于增菌液中。

（2）将已接种的匹克增菌液置44.5℃的水浴中培养至出现明显的浑浊。

（3）挑取浑浊液．涂片，染色，镜检和观察其形态。若其形态和上面所述的一致，可初步视为粪链球菌。

3 ．分离纯化培养

（1）培养基成分及其制备：

① 酪氨酸山梨醇醋酸亚铊琼脂基础培养基：

蛋白胨10 克

酵母膏l 克

山梨醇2 克

酪氨酸5 克

琼脂12 克

蒸馏水1000 毫升

将各成分溶化后分装于250毫升三角瓶中．每瓶100 毫升，112℃蒸气下灭菌10分钟。即为基础培养基。

完全培养基：调基础培养基的pH 为6.2 后，无菌地按基础培养基的比例加入以下成分即成。

三苯四唑化氮0.01%

醋酸亚铊%

山梨醇0.4%

将灭菌后的基础培养基立即注入培养皿为底层，然后每皿内加一层完全培养基，则得双层平板培养基。用于分离链球菌。

② 醋酸亚铊琼脂：

醋酸亚铊l 克

蛋白胨10 克

酵母膏10 克

葡萄糖10 克

琼脂13 克

蒸馏水1000毫升

将各成分溶于水、调pH 为6.0，煮沸1分钟分装入三角瓶．每瓶100 毫升，15 磅灭菌15 分钟，冷至50℃ ，每100 毫升中加1%三苯基四唑化氮（TTC ）溶液1 毫升，混合均匀，制成平板。

此培养基用于鉴别链球菌。接种物在这种琼脂平板上，于35-37 ℃ 培养12 小时后，可观察到：粪链球菌菌落中央红色，有或无窄的白色边缘；乳链球菌菌落深红色．坚忍链球菌、牛链球菌等菌落为粉红色或微红色．

（2）分离接种：

① 将增菌培养物在分离琼脂平板培养基上划线或涂布接种，或将经水样过滤的集菌滤膜直接贴于分离琼脂平板培养基上（滤纸与平板上不得含气泡）

② 于44.5℃的厌氧条件下培养至长出明显的菌落。如不纯可重复以上步骤在平板培养基上划线纯化．最后接种于斜面培养基上密封保存，以便做生理生化和血清鉴定用。

另法是．从分离琼脂平板上挑选暗色的链球菌菌落于鉴别琼脂平板上涂布或划线接种，于35-37℃ 下培养，12 小时后，长出明显菌落，选其菌落中央红色、边缘白色的菌落，接种纯化．

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