《水生微生物实验法》——噬菌体的分离

噬菌体广泛分布于自然界中，凡有细菌存在的地方，就有可能有其相应的噬菌体出现，那末就可能从海水、淡水和污水中，甚至是海泥或海产品中分离到噬菌体．

1 ．水中噬菌体的分离

常用的方法有滤菌器过滤法和加热法两种。

（1）过滤法：

取水样300 毫升．加到100 毫升四倍浓度肉汤蛋白胨培养基内，再加入要分离的噬菌体的相应幼龄（如肠道细菌，经6-8 小时培养）菌液3-4 毫升。在37℃孵育18-24 小时后，以每分钟2000转速离正沉淀30 分钟．上清液经赛氏滤菌器过滤，滤液鉴定．

（2）加热法：

由于使用滤菌器过滤，常能吸附一部分噬菌体．若液体内噬菌体数量不多时，较难分离成功。而加热法是根据噬菌体的耐热性较一般无芽胞细菌高，故用较高的温度将大部分细菌杀死，噬菌体仍保存着，经过多次反复，使液体中的噬菌体数量增多．最后经过滤器的液体则含有众多的噬菌体。

分离过程如下：将5-10 毫升污水加至10-20加毫升肉汤内，混合后加热56 ℃小时或60℃半小时，取出离心（每分钟1500转）沉淀10 分钟。取上清液2-4 毫升加于5-10 毫升肉汤培养基中，再加幼龄的相应菌液0.5毫升，在37℃ 培养18-20 小时，重新加温，离心沉淀，取上清液加于肉汤中，加菌液、培养。如此反复3-4 次，最后经赛氏滤菌器过滤，滤液供鉴定。

2 ．噬菌体的鉴定

将已知菌密密地涂布于肉汤蛋白胨琼脂平板表面上，取待测的噬菌体液滴于平板上，每板分成三等分，每份1 滴．在37℃ 下培养24小时后．检查有无透明菌斑出现，以说明滤液中是否含有已知菌的相应噬菌体．

3 ．从贝类中分离纯化噬菌体

现已知有100多种病毒可从人或动物肠道，或其他分泌物中排泄出来．而污染水源，而贝类动物及其他功物能聚集人类致病性病毒．不少学者报道在海水、海洋浮游生物、海产贝类和污水中发现，并分离出病毒。Moson 和Moclean( 1962 ）证实了生牡蛎妨内存在着肝炎病毒。由于噬菌体对宿主有高度的特异性．则可利用其宿主作为敏感菌株去培养和发现它们，并根据其对宿主细胞的裂解，可在含有敏感菌株的平板培养基上出现可见的噬菌斑，且一个噬菌体产生一个噬菌斑，一种纯的噬菌体具有相同形态大小的噬菌斑，故可将某种样品中的噬菌体分离与纯化。

（1）贝类样品的处理：取三个活牡蜘，用自来水洗刷贝壳表面，洗净后用无菌水洗三次。放于铺有经高压消毒的四层纱布的解剖盘上．取无菌解刻刀解剖其肉，无污染地研磨成浆，加无菌水100 毫升经离心（2000转／分25分钟）去沉淀。

（2）增殖培养：取前步骤的上清液，全部加双倍浓度肉汤蛋白胨培养基100 毫升及所要分离的噬菌体的幼龄宿主，如大肠杆菌、痢疾杆菌或葡萄球菌等悬浮液2 毫升，于37℃下培养12-24 小时。

（3）噬菌体裂解液的制备：

将增殖培养液以2500 转／分离心15 分钟，取上清液经蔡氏滤器过滤，并将滤液倒入另一个无菌的三角瓶中，置37 ℃ 下培养过夜．以作无菌检查．

（4）噬菌体的检验：上述滤液若无菌生长，可作有无噬菌体存在的检验，其方法如下：

① 将宿主菌悬液涂布接种于肉汤琼脂平板培养基上。

② 待平板面菌液干后，按三等分各滴上1 小滴无菌滤液于平板上。将平板置于37 ℃培养过夜，如果滤液内有相应宿主的噬菌体存在，则加滤液处便无宿主菌生长，而呈蚕食状的空斑，即噬菌斑，这证明了噬菌体存在。

③ 如已证明有噬菌体存在，可再将滤液接种于已同时接种有宿主菌的肉汤培养基内，如此重复移种数次，即可使噬菌体增多。

4.纯化培养

（1）将含有噬菌体的滤液用肉汤液体培养基，按10倍稀释法稀释成10^-1-10^-5等5 个稀释度。

（2）向装有4 毫升已融化的，保温在50℃左右水浴箱中的琼脂管加0.1毫升宿主杆菌液，并对号加入0.1毫升各稀释度的滤液，摇匀。然后，对号倾入直径为9厘米的装有10 毫升已凝固的底层琼脂平皿上．

（3）待倒入的上层琼脂凝固后．置于37℃培养18-24 时。

（4）待出现噬菌斑后，用接种针在选定的噬菌斑刺一下，接种于含有宿主菌的肉汤培养液中，于37℃ 培养18-24 小时，再依上述方法稀释．倒平板分离，直到平板上出现的噬菌斑形态大小一致．则表明已获得纯化的，相应于宿主菌的噬菌体。

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