几种培养基选择性分离稀有放线菌的方法

放线菌作为新的生物活性代谢产物的主要来源早已成为人们关注的焦点。自从链霉菌素的发现 ， 大量抗生素从Streptomyces 和Streptovertieilliura分离得到， 例如氯霉素、氨基苷类、 四环素、 大环内酯类和头孢霉素等…。因此，放线菌被认为是一类具有重要经济及研究价值的微生物。长期的研究重点集中在土壤中的优势菌链霉菌上。对这一类群菌的广泛筛选， 的确发现了很多新种，而且它们能产生多种有用次生代谢产物 。然而，随着大量生物活性物质的不断发现，从链霉菌得到新的生物活性物质的几率逐渐下降。同时，另一类菌——稀有放线菌逐渐引起了新药开发研究者们的注意。

本文主要从分离培养基的设计角度，介绍了几种主要的且能产生生物活性物质的稀有放线菌高选择性分离方法。根据目的菌对各种条件的耐受范围和有利于它们生长的条件，选择和设计培养基的成分、 酸碱度等。 

葡萄糖—天门冬酰胺改良培养基、淀粉—甘油培养基和甘油—酪素培养基成分均能促进稀有放线菌的生长。分离培养基中加入4种抗生素抑制细菌和真菌的生长，有利于稀有放线菌分离。 

分离程序如下：沙漠土样用溶液稀释，溶液组成为：K₂HPO₄  0.38％ ， KH₂PO₄  0.12％ ， MgSO₄·7H₂O   0.51 ％ ，NaCl  0.25％， Fe₂ (SO₄ )₃·7 H₂O   0.005％ ， MnSO₄    0.005％。

选用3种分离培养基，分别是：

(1)葡萄糖一天门冬酰胺改良培养基： 葡萄糖 1 ％， 天门冬酰胺 0.1 ％， K₂HPO₄  0.1%， FeSO₄·7H₂O  0.0001％， MnC1₂·4 H₂O  0.0001％， ZnSO4·7H₂O  0.001％， 琼 脂1.5％ ， pH7.0；

(2)淀粉一甘油培养基 ： 淀粉 1.0％， 甘油1.0％ ，(NH₄)₂SO₄  0.2 ％， CaCO₃  0.2％ ， KH₂PO₄   0.1％， MgSO₄·7 H₂O  0.1 ％ ， NaC1   0.1 ％， 脯氨酸 l ％ ， 琼脂1.2％ ，pH7.0； 

(3)甘油 一酪素培养基 ：甘油 1.0％， 酪素0.03％ ，KNO₃ 0.2％ ， NaC1  0.2％ ， K₂HPO₄  0.2％ ， MgSO₄·7 H₂O  0.005％ ， FeSO₄·7 H2O  0.001％， CaCO₃   0.02％ ， 琼脂1.8％ ， pH7.0。 

制霉菌素12.5m g／m L， 苯菌灵 20mg／mL ， 环丝氨酸 50mg／m L， 萘啶酸25 mg ／m L均加入3种分离培养基。稀释涂布平板法分离，37℃培养 ，7 d 。

吉兰糖胶是一种由Pseudomonas elodea产生的多糖。常用作植物组织培养的凝固基质， 有促进植物细胞生长的作用。它也能促进很多放线菌气生菌丝的生长及气生孢子的形成 ， 如Sporichthya ，Actinobispora ，Planobispora， Plano—monospora等。因此，可以用作稀有放线菌分离培养基的凝固基质。

通常分离产动孢的游动放线菌， 如Planobispora ，Planomonospora等， 利用它们孢子的游动性， 可用诱饵捕集法、化学趋化法和离心法，如Nonomura等人用花粉或角蛋白诱饵捕集法成功地分离得到Actinoplanesspp．， Pilimelia和Planomonospora  spp ．； 化学趋化法选择性分离Actinoplanes ，Catenuloplanes和Dactylosporangium ； 离心法将动孢菌与链霉菌等不产动孢的放线菌分开， 选择性分离稀有产动孢的放线菌。Suzuki介绍了一些利用吉兰糖胶特异性分离此类放线菌的方法。 

2．1 选择性分离 Sporichthya  Sporichthya  polymorpha在查氏琼脂上形成的菌落小，难以辨别。而在HV吉兰糖胶上形成的菌落大，便于快速鉴定。同样，Sporichthya在几丁质琼脂(Colloidal  chitin agar )、放线菌分离琼脂 ( Actinomyceteisolation agar ) 、蛋清琼脂 (Egg  a lbuminagar ) 和 HV琼脂上形成的气生菌丝都不及HV吉兰糖胶丰富。实验研究表明，Ca²⁺促进Sporichthya polymorpha 生长 。Ca²⁺加入HV吉兰糖胶以提高对Sporichthya的选择性 。

    Suzuki等用脱脂牛奶对土样进行预处理，可刺激Spofichthya孢子的运动。需要引起注意的是，高温能够破坏脱脂牛奶中的刺激因子，所以脱脂牛奶不能进行高温灭菌。pH8.0时， 孢子运动频率最大。吗啉丙磺酸 ( MOPS， pH8.0 ) 有助于 Sporichthya孢子的运动，提高了分离效率。差速离心是分离动孢菌的有效分离方法之一。脱脂牛奶结合离心法提高了分离的选择性。分离程序如下：将风干土样在80℃干热处理，l h ， 用含0.1％脱脂牛奶 (未灭菌) 的MOPS ( morpholinepropanesulfonic  acid，pH8.0) 浸液制成土壤悬液，27℃振荡培养 1 h ，离心1000 r／m i n ，10 m i n，用无菌生理盐水梯度稀释后， 涂布HVG平板( CaC1₂ 2mM， 放线酮50μg／m L) ， 27℃培养，21～2 8d。 

2.2 选择性分离  Planobispora  Planobispora通常形成棒状孢囊，孢囊内包含一对纵生的孢子。这是Planobispora  典型的形态特征。Planobispora在一些标准分离培养基，如淀粉一硝酸盐酪素琼脂、 放线菌分离琼脂和蛋清琼脂上不能或稀疏形成孢囊。相比之下，在HSG上能够产生丰富的孢囊。有意思的是，当Planobom菌落数超50个时，在吉兰糖胶培养基上能够产生丰富的孢囊，而菌落数少于20个时， 在气丝上不能形成孢囊 。

HSG即腐殖酸微量盐吉兰糖胶。其中微量盐包括FeSO₄·7H₂O，MnCl₂·4H₂O，ZnSO4·7H₂ O，NiSO₄·6 H₂O。它们在低浓度情况下，可以促进孢囊的形成。在高浓度条件下，却抑制孢囊的形成。碱性条件增加了有机物质的降解，利于产孢囊的动孢菌生长。pH 9.0比中性pH更利于Planobispora孢囊的形成。同时，碱性条件也可以抑制优势菌链霉菌的生长，提高对Planobispora的分离效果。当培养温度为 32～37℃时，不利于非目的菌的生长，而对Planobispora的生长却不构成影响。Suzuki等采用32℃培养，以减少水分的蒸发， 同样达到选择性分离的效果。

分离程序如下：风干土样在90℃干热处理，1h ， 用CHES ( 5mM  pH9.0 ) ，脱脂牛奶0.1％ ， 吐温80  0.01％， 三甲氧苄二氨嘧啶 100μg／mL和萘啶酸100μg／mL 制成土壤悬液 ，35℃振荡l h ，离心1000g，10min ，用无菌生理盐水梯度稀释后，涂布HSG平板(三甲氧苄二氨嘧啶50g/ mL，萘啶酸50μg／mL ，依诺沙星20μg／mL ，氨苄青霉素钠盐2g／m L，硫酸链霉素1g／m L，放线酮50μg／m L，制霉菌素5 0μg／mL ，pH 9.0) ，32℃培养，14～21d 。 

2.3选择性分离  Planomonospora  Planomonospora在一些分离培养基，如淀粉—硝酸盐酪素琼脂、 放线菌分离琼脂和蛋清琼脂，不能形成特征性孢囊。而在HSG上能够产生丰富的孢囊。虽然在 HVA上， Planomonospora 也形成孢囊，但与HSG相比，稀疏得多。分离培养基的碱性环境利于Planomonospora孢囊的形成。CHES ( pH 9.0 ) 和 0.1 ％脱脂牛奶对动孢菌的分离效果得到进一步的验证。

分离程序如下：风干土样在100℃干热处理， 1 h ，用CHES ( 5 mM  pH 9.0 ) 和0.1％脱脂牛奶制成土壤悬液，32℃ 振荡90 mi n ， 离心1000 g，10 m i n， 32℃再培养，1 h ， 涂布 HSG平板(三甲氧苄二氨嘧啶20μg／mL，萘啶酸20μg／m L， 依诺沙星20μg／m L，氨苄青霉素钠盐2g／mL，放线酮50μg／m L，制霉菌素50μg／mE )，35℃培养，14-21d 。 

2.4选择性分离   Actinomadura   rugatobispora  Actinomadura   rugatobispora形成绿色的气生菌丝，并在气生菌丝上产生丰富的纵向排列的成对孢子，孢子表面多皱，有脊。  A．rugatobispora容易从形态特征进行鉴别。在一些分离培养基上，如淀粉—硝酸盐酪素琼 脂、 放线菌分离琼脂和蛋清琼脂，A．rugatobispora不产生孢子。在HVA上，部分菌株当平板上菌落数只有5～20个时，产生稀疏的孢子。而在 HMG上，都能产生丰富的孢子。 

HMG即HVG中另外加入1g／L吗啉丙磺酸( MOPS ) ，维持培养基pH8.0，利于A．rugatobispora的生长。分离培养基中加入硫酸庆大霉素和氨苄青霉素钠盐，用于抑制链霉菌等非目的菌的生长。

分离程序如下：风干土样在120℃干热处理，l h ，用无菌生理盐水梯度稀释制成土壤悬液，涂布平板( HMG，硫酸庆大霉素100 g／mL， 氨苄青霉素钠盐20g／mL ，三甲氧苄二氨嘧啶50μg／mL， 萘啶酸10μg／m L，放线酮50μg／mL ， 制霉菌素 50μg／mL ) ， 35℃培养，2l～ 28 d 。

3 结束语