淋球菌保存方法的实验研究

摘要：  

目的  为了经济、简便地贮藏淋球菌以利于对淋球菌进行研究，我们特对目前几种保存淋球菌的方法进行比较实验，以便找到最理想的贮存方法。  

方法  用鲜奶法、脱纤维血法、普通奶粉法和冷冻真空干燥法四种方法同时保存85株淋球菌。  

结果  冷冻真空干燥法一年和二年内复苏，复活率均为100％； 鲜奶法一年内复苏，复活率为100％， 二年内复苏，复活率为97．7 ％， 脱纤维血法一年内复苏，复活率为100％，二年内复苏，复活率为82．3 ％，上述三种方法明显高于普通奶粉法组( 9.4 ％， 1.2％) ，差异均具有显著性( P<0.01 ) 。  

结论  鲜奶法保存淋球菌具有经济、简便实用、存活率高等优点，是一种较理想的贮存淋球菌的方法。短期(一年内) 脱纤维血法也是一种较理想的贮存淋球菌的方法 。 

 

 

淋病奈瑟菌又称淋球菌 (gonococcus ) ，是引起人类泌尿生殖道急慢性炎症的主要性传播疾病之一，为我国目前流行的发病 率极高的性传播疾病病原，其培养要求很高，实验室常规保存极其困难，这给科研和教学带来诸多不便。目前，淋球菌保存一般采用传统的冷冻真空干燥法，此法虽然可靠，但操作繁琐费时，需要贵重仪器一冰冻干燥机和真空泵等，成本较高。 如何简单而又可靠地长期保存淋球菌，一直是广大科研工作者关心的课题，已报告的菌种保存方法有多种，但是对营养要求苛刻的淋球菌，哪种方法最理想呢?为此我们经过多年大量实验，得出了一种最实用可靠的淋球菌培养保存方法，现报告如下 。 

1   材料与方法

1.1 淋球菌菌种  共85株， 其中 8 4株为本院2001-2005年性病门诊患者泌尿生殖道分泌物中的分离菌，1株标准株，标号为 ATCC49226 。 

1.2新鲜奶保存液的制备  用无菌1000ml 三角瓶在奶牛场现场取鲜奶500ml ，巴氏消毒 ( 62℃ 30 min ) 消毒脱脂三次加0.1 ％葡萄糖、5％胎牛血清，用0.1NNaHCO₃调pH至7.4分装于小试管，每管0.5 ml，加橡皮塞 4℃保存备用。 

1.3 普通奶粉保存液的制备  取南山牛奶粉 200g ，加无菌蒸馏水500ml 摇匀，巴氏消毒法消毒脱脂三次，加0.1 ％葡萄糖5％胎牛血清 ，用0.1NNa HCO₃调pH 至7.4， 分装于小试管和菌种管，每管0.5ml，加橡皮塞4℃保存 。 

1.4脱纤维血保存液的制备  用无菌手续抽取羊颈静脉血注入已灭菌的带玻璃珠瓶中以脱去纤维，然后分装加盖无菌小试管中，每管约2 m1，加橡皮塞 4℃保存 。 

1.5 血消化液淋球菌选择培养基制备    血消化使用液1000m1， 氯化钠5.0 g，玉米淀粉 1.0g， 纯化琼脂14.0 g， 高压蒸汽灭菌，冷却至80℃～90℃时加7％绵羊血( 或兔血)，边加热边摇动至咖啡色，55℃时加以下添加剂：0.15％葡萄糖，7.5 mg／L多粘菌素B， 3 mg / L万古霉素和12500 u／L制霉菌素，摇匀倾注平皿，3 7℃2 4 h作无菌实验，并接种已知淋球菌，置5％CO₂ 孵箱(若没有CO₂孵箱，可用烛缸法：置于干燥玻璃缸，点燃蜡烛用凡士林封口密闭容器，待蜡烛熄灭相当于5％～10％CO₂ 培养)35℃  24～48 h作质量鉴定， 合格者供用。也可用其它商品化淋球菌培养基，如GC培养基、TM培养基、New York培养基等  。 

1.6 淋球菌的复苏与保存  按全国临床检验操作规程，先将85株淋球菌接种在血消化液淋球菌选择培养基平皿上，5％CCh孵箱(若没有CO₂孵箱，可用烛缸法：置于干燥玻璃缸，点燃蜡烛用凡士林封口密闭容器，待蜡烛熄灭相当于5％～1 0％ CO₂ 培养) 3 5℃ 2 4 ～4 8   h复苏， 然后用接种环挑起菌落放入上述试管和菌种管中，充分磨匀，将三种含有淋球菌的小试管加橡皮塞后置-70℃冰箱中冻存。将含种有淋球菌的菌种管，先用冷冻干燥机快速冻干，然后用真空泵和酒精喷灯密封菌种管，4℃冰箱保存。一年和二年后用同样的方法开启用上述三种方法保存的85株淋球菌，每株每种方法复苏三支菌 ，观察淋球菌复苏情况， 计算淋球菌平均存活率。 

1.7统计学处理所得数据用χ²检验行统计分析 。 

2 结果

采用四种方法保存85株淋球菌，一年、二年复苏存活率， 冷冻真空干燥法均为100％； 新鲜牛奶法分别为100％和97.7％；脱纤维血法一年内复苏，复活率为100％，二年内复苏， 复活率为70.9％，普通奶粉法分别为9. 4％和1. 2％。前三种方法之间差异无统计学意义 ( P>0.05 )，但三者与普通奶粉法比较， 差异均具有统计学意义 ( P<0.01 )，见表1 。 

 

 表 1   四种保存淋球菌方法一、二年存活率比较

 

 

 注 ： VS#P>0.05， *VS@ P>0.05 ， # VS@ P >0.05 ， *、 #或@V S 普通奶 P <0.01 

3   讨论

从四种保存淋球菌方法的结果来看，用传统的冷冻真空干燥法淋球菌存活率为100％， 此法是先将微生物在低温中迅速冷冻，然后在高真空状态下迅速脱水干燥，真空密封而成。干燥细菌或病毒时常用脱脂牛奶做保护剂，这种方法可维持微生物生命达数年之久 。但此法操作繁琐、费时、费力，需价格昂贵的冷冻真空干燥机和真空泵等设备，故成本较高，给实际工作带来诸多不便。普通奶粉法，其主要成份虽为牛奶，操作也简便，成本低，但奶粉在加工处理过程中可能有些营养成分被丢失或增加了某些添加剂(成份变化有待进一步检 测)，不利于营养要求较高的淋球菌的代谢，实验结果显示其一年和二年存活率仅为9.4％和 1.2％，与冷冻真空干燥法比较，差异显著有统计学意义( P<0.01)。脱纤维血法，本身就含有血的成份，无需添加其它营养成份，操作简单，经济实用，一年存活率为100％，但二年存活率下降较大，只有82.3％，因而此法保存淋球菌株最好不超过一年，短期保存淋球菌菌株， 此法值得推广。鲜奶法，牛奶未经工业加工处理，营养成份基本上未丢失，无任何添加剂 ，  并添加了适量的葡萄糖和胎牛血清，有利于淋球菌的代谢，-70℃冰箱保存，一年、二年内存活率分别为100％和97.7％，与冷冻真空干燥法比较，差异无显著性( P>0.05 ) ，此法操作简单易行，经济实用，保存细菌存活率高，是一种较为理想的淋球菌保存法，具有较高的推广价值，特别适用于从事淋球菌研究的科研和教学单位。而对于基层医疗单位实验室条件有限，脱纤维血法和鲜奶法保存淋球菌更是非常适用的方法。 

众所周知，淋球菌是一种比较娇嫩的细菌，营养要求极高，比较难培养和保存。一般来 说 ， 适宜淋球菌生长的培养基其它细菌基本上能生长，是否可以推测保存淋球菌的鲜奶法和脱纤维血法也可用于其它细菌的保存，有待进一步研究。另外，本实验仅观察了二年内的数据，鲜奶法是否能保存二年以上还有待 进一步探讨。而脱纤维血法保存最好不超过一年。