水中大肠杆菌mTEC培养基检验方法－滤膜法

一、       方法概要

本方法系以0.45 μm孔径之滤膜过滤水样，检测水中大肠杆菌(Escherichia coli)。水样过滤后置于mTEC培养基(modified membrane-Thermotolerant Escherichia coli Agar，缩写为modified mTEC Agar)上，于35±1℃培养2小时，再以44.5±0.5℃培养22~24小时，大肠杆菌会形成红色或紫红色菌落。

方法原理是培养基内含之色原(5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸，5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)被大肠杆菌之尿甘酸化酶(β-D-glucuronidase)催化而产生红色或紫红色菌落。

 

二、       适用范围

本方法适用于饮用水水质、饮用水水源水质、地面水体、地下水体、废水、污水、及海水等水样中大肠杆菌之检验。但不适于高浊度及含有干扰物质水样之检测。

三、       干扰

（一）    水样中含有抑制或促进大肠杆菌生长之物质时，会影响水样之检测结果。

（二）    检验使用的玻璃器皿及设备含有抑制或促进大肠杆菌生长之物质时，会影响水样之检测结果。

（三）    悬浮微粒过高或含有胶体的水样易造成滤膜孔隙阻塞，或造成细菌菌落弥漫生长(Spreading)而影响水样检验结果之判读。

 

四、       设备

（一）    量筒：一般使用100~1000 mL之量筒。

（二）    吸管：一般使用1~10 mL之灭菌玻璃吸管或无菌塑料吸管，应有0.1 mL之刻度。

（三）    稀释瓶： 100~1000 mL能耐高压灭菌之有盖硼硅玻璃制品。

（四）    三角锥瓶：250~2000 mL能耐高压灭菌之硼硅玻璃制品。

（五）    采样容器：无菌之玻璃或塑料制有盖容器，使用市售无菌袋亦可。

（六）    培养皿：硼硅玻璃或可抛弃式塑料制培养皿。可使用60×15 mm、50×12 mm或其它适当大小者。

（七）    过滤装置：能耐高温高压灭菌之玻璃、塑料、陶瓷或不锈钢等材质构成之无缝隙漏斗，以锁定装置、磁力或重力固定于底座。

（八）    抽气帮浦：水压式或吸气式，压力差最好在138至207 kPa者。

（九）    滤膜：使用直径47 mm、孔径0.45 µm且有格子记号的无菌滤膜，能使水中大肠杆菌完全滞留者。

（十）    镊子：前端圆滑内侧无波纹。

（十一）水浴槽：温度能维持在50℃左右者。如用于44.5℃培养，温度必须能维持在44.5±0.5℃。

（十二）培养箱：温度能维持在35±1℃者。如用于44.5℃培养，温度必须能维持在44.5±0.5℃。

（十三）       加热板：附磁石搅拌功能者。

（十四）       天平：能精称至0.01 g者。

（十五）       高压灭菌釜：能以中心温度121℃（压力约15 lb/in2或1.1 kg/cm2）灭菌15分钟以上者。

（十六）       烘箱:用于玻璃器皿等用具之干热灭菌，温度能维持在160℃达2小时或170℃达1小时以上者。

 

五、       试剂及材料

本方法所使用的化学药品均为试药级，培养基为微生物级制品。

（一）    培养基

mTEC培养基(modified mTEC Agar）成份：

3号蛋白胨(Protease Peptone ＃3)      5.0 g

酵母抽出物(Yeast Extract)   3.0 g

乳糖(Lactose) 10.0 g

氯化钠(Sodium Chloride)      7.5 g

磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate)   3.3 g

磷酸二氢钾(Monopotassium Phosphate)     1.0 g

硫酸月桂酸钠(Sodium Lauryl Sulfate) 0.2 g

脱氧胆酸钠(Sodium Desoxycholate)    0.1 g

5-溴-6-氯-3-吲哚-β-D-尿甘酸(5-Bromo-6-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)       0.5 g

琼脂(Agar)     15.0 g

使用市售商品化培养基45.6 g，加入1公升的蒸馏水，煮沸溶解后以121℃高温高压灭菌15分钟，培养基最终pH值应为7.3±0.2。取出后置于45~50℃之水浴槽待温度下降至恒温，培养基混摇均匀后分装于培养皿中，厚度约3~5 mm。凝固后避光保存于冰箱中备用，分装后之培养基保存期限为14天。可依检测需要量按比例适量配制。

（二）    无菌稀释液

       无菌稀释液一：非海水水样检测稀释用。配制方法如下：

       磷酸二氢钾储备溶液

取3.4 g磷酸二氢钾（KH₂PO₄）溶于50 mL的蒸馏水中，待完全溶解后，以1.0 M NaOH溶液调整其pH值为7.20±0.05，然后加蒸馏水至全量为100 mL，灭菌(过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟)后，储存于冰箱中作为储存液备用。

       氯化镁储备溶液

取8.1 g氯化镁（MgCl₂‧6H₂O）先溶于少量蒸馏水，待完全溶解后，再加蒸馏水至全量为100 mL，灭菌(过滤灭菌或121℃高温高压灭菌15分钟)后，保存于冰箱中作为储存液备用。

       无菌稀释液

分别取10 mL氯化镁储备溶液和2.5 mL磷酸二氢钾溶液，加入蒸馏水至全量为2000 mL，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃高温高压灭菌15分钟，作为无菌稀释液备用。

       无菌稀释液二：海水或含盐水样稀释用。

磷酸二氢钠(NaH₂PO₄)  0.58 g

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)  2.50 g

氯化钠(NaCl) 8.50 g

将上述成分溶解于1公升的蒸馏水中，混摇均匀后，分装于稀释瓶中，经121℃灭菌15分钟，其灭菌后之pH值为7.4 ±0.2。

六、       采样与保存

（一）    采取微生物检测之水样时，应使用清洁并经灭菌之玻璃或塑料容器或市售无菌采样袋。且于采样时应避免受到污染。水样若含有余氯时，无菌容器中应加入适量无菌之硫代硫酸钠（120 mL的水样中加入0.1 mL、10﹪的硫代硫酸钠可还原15 mg/L的余氯）。

（二）    水样运送及保存之温度应维持在0~5℃并于采样24小时内完成检测。

（三）    水样量以能做完所需检测为度，但不得少于200 mL。

七、       步骤

（一）    水样在进行检测或稀释之前必须剧烈摇晃25次以上，以使样品充分混合均匀。

（二）    水样稀释：

       饮用水水样不需稀释。

       其它样品则视水样中大肠杆菌可能浓度范围进行水样稀释。

使用无菌吸管吸取10 mL之水样至90 mL之无菌稀释液中，形成10倍稀释度之水样，混摇均匀。而后自10倍稀释度水样以相同操作方式进行一系列之100、1000倍等稀释水样，并混摇均匀。进行上述稀释步骤时，均需更换无菌吸管。

（三）    以无菌镊子夹起无菌滤膜，放在无菌过滤装置之有孔平板上，小心将漏斗固定。将过滤装置接上抽气帮浦。加入适量无菌稀释液，以测定过滤设备是否装置妥当。

（四）    检验饮用水水样时，直接过滤100 mL的水样。其它水样视大肠杆菌可能浓度范围，以无菌吸管吸取10 mL的原液及（或）各稀释度水样至无菌过滤器中过滤。过滤后，再以20至30 mL之无菌稀释液冲洗漏斗。每个稀释度水样均需进行两重复。

（五）    冲洗过滤后，解开真空装置，将漏斗移开，尽速以无菌镊子取出过滤后之滤膜置于培养基上。滤膜应与培基完全贴合，避免产生气泡。培养皿倒置于35±1℃的恒温培养箱中培养2小时，然后再于44.5±0.5℃的培养箱或水浴槽中培养22~24小时。如放置于水浴槽中培养，应将培养皿倒置密封于防渗水塑料袋内(如采样袋)，塑料袋须完全浸入水中。如使用松盖培养皿放置于培养箱中培养，应将培养皿放置于密闭容器中，且容器内侧底部应放置湿纸巾或湿布，以避免培养基之水份丧失而影响细菌生长。

（六）    过滤不同稀释度水样时，应更换无菌过滤器（漏斗）。亦可将过滤器（漏斗）以火烤后约降至室温重复使用。

（七）    计算并记录各稀释度培养皿中所产生的红色或紫红色菌落。若菌落过多造成判读困难，则以「大肠杆菌菌落太多无法计数」（E. coli Too numerous to count ; TNTC）表示。

八、       结果处理

（一）    选取大肠杆菌菌落数介于20至80间之同一稀释度的两个培养皿，计算其每100 mL水样之大肠杆菌菌落数，单位为CFU/100mL。计算公式如下：

大肠杆菌菌落数=所选取培养皿之红色或紫红色菌落数×100(CFU/100mL) 所选取培养皿之实际水样体积总合

（二）    培养皿之大肠杆菌菌落数不在20至80个菌落之间时，则以下列方式处理：

       若原液及各稀释度水样中仅有一个稀释度的一个培养皿菌落数在20至80 个之间，则选取该稀释度的两个培养皿以上述公式计算之。

       若仅原液有大肠杆菌菌落产生，且少于20个，应循上述公式计数菌落数；若过滤100 mL原液，培养皿中均无菌落生长，则结果以「<1 CFU/100mL」表示；若过滤10 mL原液，培养皿中均无菌落生长，则结果以「<10 CFU/100mL」表示。

       若各培养皿之大肠杆菌菌落数均不在20至80个之间，则选取大肠杆菌菌落数最接近80之同一稀释度的两个培养皿以上述公式计算。但不可选用菌落总数大于200之培养皿。

（三）    数据表示：菌落数小于100时，以整数表示（小数字四舍五入），菌落数大于100 以上时，取两位有效数字，并以科学记号表示，例如菌落数为112时以1.1×10² 表示之，菌落数为117时以1.2×10² 表示之，菌落数为65000时以6.5×10⁴ 表示。

（四）    检测纪录必须注明采样时间、开始培养时间、结束培养时间、培养基名称及各稀释度的原始数据。

九、       质量管理

（一）    微生物采样及检测人员应具备微生物基本训练及知识。

（二）    进行微生物检测时，所用的盛装器具均应经灭菌处理。

（三）    每次采样时，应进行一组运送空白及野外空白。

（四）    每批次或每10个水样须进行一次试剂空白。

（五）    新购之mTEC培养基，每批次均须以已知的大肠杆菌及非大肠杆菌(例如Bacillus subtilis)之菌株作测试，以确保数据质量。

（六）    若连续一个月水样均未检出大肠杆菌，则须以大肠杆菌菌株进行培养基测试，以确保数据质量。

（七）    应记录所有稀释度水样的原始数据，以备查核之用。

（八）    每个稀释度水样至少须进行二重复。

（九）    本方法培养所得之细菌可能具有感染性，检测后之培养基及器皿应经高温高压灭菌处理。