新疆奎屯地区高砷环境中抗砷菌的初步筛选

【摘要】  

目的     初步筛选新疆奎屯地区高砷环境中(123团4连)自流井水和污水中存在的高抗砷菌，检测其抗砷能力。

 

方法     选择高砷自流井水和污水标本，在NaAsO₂选择性培养基上，分离和纯化，筛选出抗砷菌，初步进行细胞形态学的鉴定；用不同Na AsO₂浓度的L B培养基对菌株抗砷性进行检测，测定其抗砷水平。

 

结果     初步筛选出5株抗砷能力较强的抗砷菌。A1、A2、A3均为革兰氏阴性杆菌 。 Bl、B2均为革兰氏阳性球菌；5株菌均可在含有NaAsO₂ (50-400 mg／L) 培养基中生长。最高耐受到400mg／L，是新疆奎屯高砷水含量实际最高值的517倍，最低值的1156倍。  

 

结论     ①经初步筛选确认新疆奎屯地区高砷环境中的自流井水和污水中存在高抗砷菌，首次成功筛选出5株强抗砷菌。②A 1菌株的抗砷能力最强，可在400mg／L  Na AsO₂ 的 LBA培养基上生长。本研究为新疆地区抗砷菌的深入研究提供了基础资料。

 

    砷 (arsenic ) 俗称“ 砒霜” 是自然界中广泛存在的有毒物质。通过自然环境中存在砷含量高的水和土壤，可使当地居民因摄人过量的砷而引发地方性砷中毒。目前世界上不断报道新出现的砷污染，新疆奎屯垦区是我国大陆上首次发现的地方性砷中毒病区，受害居民10万人．经过20年坚持不懈的防病改水干预措施．使该病区在地方性砷中毒的防治方面取得了显著成效。利用生物技术防止污染、改造环境是当今世界提倡“绿色”环保的一个研究方向．因此对氟砷污染地区利用微生物技术改造也自然成为一个新的研究热点。新疆是氟砷中毒高发区，奎屯垦区氟砷中毒最为严重。该地区为新疆地势最低洼地，天山山脉富有含氟砷矿物，提供了氟砷来源。其独特的地理环境存在着丰富的微生物研究资源。由于高氟砷水多埋藏于地下深处，因此从新疆奎屯地区高砷环境中的自流井水和污水中寻找高抗砷菌，具有可能性和重要实用意义。目前新疆在抗砷菌的研究方面还是空白．本实验从新疆奎屯地高砷水环境中筛选出多株抗砷菌，并进行了形态学检验和抗砷能力的测定。为新疆地区抗砷菌的深入研究及以后采用微生物治理水环境污染问题提供宝贵的基础研究资料。 

 

1 材料与方法

1.1材料

 

1.1.1研究对象    2008年3月采集新疆奎屯地 (123团4连) 高砷自流井水和污水。研究对象纳入标准：根据新疆公卫学院提供的资料，分别取123团4连的砷污染最严重的自流井水 ( 砷0.347± 0.773 μg／L )  和附近的污水为分离、培养标本。

 

1.1.2标本采集    采用100 ml的无菌玻璃瓶，严格无菌操作，分别用50m l的一次性无菌注射器抽吸自流井水和污水后，置于无菌瓶中。做记录后，将无菌瓶置于冰袋中，尽快送实验室进行分离培养。 

 

1.1.3主要仪器与试剂   哥伦比亚琼脂、N aAsO₂、电热恒温三用水浴箱、高压蒸汽灭菌锅、 超净工作台、电冰箱、核酸／蛋白分光光度计( BIO—RA D美国)、电热恒温培养、SIM—F124雪花制冰机(日本三洋) 、O1ympus BH2显微镜( 德国) 等。 

 

1.2方法

1.2.1抗砷菌的分离与纯化     根据文献中记载的方法操作如下：

 ①取自新疆奎屯高砷环境中自流井水和污水标本，在无菌三角烧杯中分别加入8ml  0.85％NaC1 ， l ml 井水样本， l ml 亚砷酸钠母液，在另一无菌三角烧杯中分别加入8 m l 0.85 ％NaCl ，l m l污水样本，  l m l 亚砷酸钠母液( NaAsO2 浓度为 1.33mol／m1 ) ， 静置 5—6 d ，27℃恒温箱培养至稳定期( 7 d左右) ；

 

 ②取原菌液，按不同梯度稀释 (10^-1,10^-2,10^-3,10^-4,10^-5 ) ， 稀释终浓度 10^-5，用移液器取100μl在LBA平皿中用接种环划线，静置15min后，倒置放入27℃恒温箱中培养24～ 72 h。挑取单个菌落接种到LBA培养皿中，进行纯化培养，获得菌株，并保存菌种；

 

③将纯化培养的菌株再接种于哥伦比亚琼脂平板进行细菌培养5—7d，挑取可疑菌落，做革兰染色，油镜镜检，见革兰染色阴性(红紫色)，革兰染色阳性(紫色) 。 

 

1.2.2抗砷菌的细胞形态学鉴定包括革兰氏染色，油镜镜检。 

1.2.3高抗砷菌菌株的筛选    筛选LB培养基：蛋白胨10g ，酵母粉5g，NaAsO₂浓度按照 50mg／L、100mg／L、200mg／L、300mg／L、400mg／L、500mg／L设置。用移液器取0.1μl 纯化培养的抗砷菌在平皿划线，28℃培养，摇床过夜，挑取单个菌落反复划线纯化， 得到相应浓度NaAsO₂培养基中生长的菌株。纯化好的菌株-20℃保存，以便后面研究使用。

 

1.2.4菌株的抗性实验   分别将抗砷菌A1、A2、A3、Bl、B2培养过夜，以1％的接种量接种在含有不同浓度亚砷酸钠的LB液体培养基中，在28℃摇床中摇菌，培养16h～18h，600nm波长下测定菌液OD值，确定NaAsO₂ 的最小致死浓度和最大抗砷浓度。大肠杆菌标准菌为阳性对照菌株 。 

 

2 结 果

2.1   5株抗砷菌菌株 A1、A2、A3、B1、B2形态特征观察     本研究共分离出新疆奎屯高砷水环境抗砷菌菌株5株，其中革兰氏阴性菌3株，以杆状为主。革兰氏阳性菌2株，以球形为主，在28℃恒温箱培养48～72 h才形成菌落，这些菌落以直径大，圆，湿润，隆起， 半透明，淡黄，粉红，桔黄色，金黄色，为主，菌种形态见表 l。 

 

表 1 初筛的5株抗砷菌基本形态特征

 

 

2.2 菌株的抗砷实验     结果NaAsO₂ 浓度按照50mg／L 100 mg／L 200mg／L  300mg／L、400mg／L  500 mg／L设置。非抗砷菌大肠杆菌作为阴性对照。 Al菌株的最大抗砷浓度为400mg／L  NaAsO₂；其余4株的最大抗砷浓度为300mg／L  NaAsO₂ 。大肠杆菌标准株在50 mg／L  Na AsO₂ 生长16 h全部死亡，见表2。 

 

表 2    菌株的抗砷实验结果

 

 

3 讨论

       随着科学技术的发展，一些特殊环境下的细菌已经显示出重要的地球化学意义及突出的环境学领域的应用前景。有研究表明。像易对抗生素产生耐药性一样，微生物会对很多金属离子(如As、Pb、Cu、和Zn等) 产生抵抗作用。古生物正是为了排除有毒金属砷、铅、镉和保持所需的金属元素铜、锌的稳定性，在生物进化中形成了维持金属离子的内稳定性和解毒机制 。 

 

       砷广泛分布于自然界的大气、水和土壤中，是一种毒性很强，且有累积中毒作用的类金属元素．土壤及饮用水被砷污染后会引起严重的健康问题。砷污染引起的中毒世界各地均有报道，以孟加拉、美国中南部、印度、西班牙，意大利、中国最为严重。在美国东北地区的饮水中，砷含量超过 50ug／L，对健康造成严重的威胁，但在调查这些地区微生物时却发现这些生物体内都有一套完整的排除毒性金属离子的完整转运体系。目前研究己分离出砷霉菌等l1个系的异养细菌具有释放砷的作用．它们能使无机态砷化物转化为有机态砷化物和砷化氢出逸出土壤，达到消除砷害的目的。近几年，随着基因工程的迅猛发展，各国对细菌抗砷基因的研究也不断深入，在基因水平上发现其对砷有一定抗性和解毒功能。抗砷菌的研究对于应用微生物技术治理改善高砷环境中水砷污染有着及其重要的意义。

     

       新疆奎屯高砷环境自流井水和污水中高抗砷微生物应当是相当丰富的，我们的研究还是初步的。首次仅分离出5株抗砷菌．大量的高抗砷菌还需我们继续发现和研究。 国外不断有报道发现原核生物的抗砷性可随细菌质粒在菌株间转移．在其质粒和染色体上陆续发现了抗砷基因，从而引发了对抗砷质粒的研究。我们对已发现的抗砷菌株还需进一步明确属和种、 生物化学特性，分析遗传背景，确定抗砷基因并克隆。