羊梭菌病多联灭活疫苗生产用厌氧培养基的研究

1  新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆乌鲁木齐  830000

2  新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生物制品事业部，新疆乌鲁木齐  830013

 

关键词：厌氧菌培养基；肉肝胃酶消化汤；产气荚膜梭菌（B型、D型）；腐败梭菌；培养试验；毒素

 

     梭菌性疾病是由厌气梭菌属中多种梭菌引起的一类各种动物的传染病，如快疫、猝狙、痢疾、肠毒血症、气肿疽、黑疫、肉毒梭菌中毒症、破伤风等。这类疾病以发病急速、病程短促来不及治疗而病死率高为特征。病原菌多为土壤性细菌，广泛存在于世界各地，造成很大的经济损失。梭菌性疾病的免疫，主要是通过灭活梭菌培养过程中所产的毒素而实现，毒素为疫苗的主要有效免疫抗原。因此，培养这类细菌，使它们大量生长繁殖并且分泌高效价的毒素、表达强毒力可以制作出免疫效果优良的疫苗。羊快疫（腐败梭菌）、羔羊痢疾（产气荚膜梭菌B型）、肠毒血症（产气荚膜梭菌D型）三联灭活疫苗就是其中一种，它可以预防羊的快疫、猝狙（产气荚膜梭菌C型）、羔羊痢疾和肠毒血症四种传染病，故称为羊梭菌病三联四防苗（简称羊三联四防苗），这种疫苗在我国广泛使用。

目前厌气梭菌的培养，多使用厌气肉肝胃酶消化汤，需要牛肉、肝、胃蛋白酶等昂贵的原料，成本高昂，工艺复杂。另一方面，受到肉品质的影响（如抗生素的残留、新鲜度等），使得培养基品质不稳定、质量不宜控制，进而影响到疫苗的品质。

本试验旨在研制一种适合于厌氧菌生长繁殖并良好产毒的培养基，可应用于厌氧菌引起的疫苗制造、疾病诊断等研究领域。替代目前常用的、成本昂贵且需要复杂处理工序的动物源性材料的培养基。

1  材料和方法

1.1  主要试剂

蛋白胨分别为上海上食肉类有限公司生产的海豚牌蛋白胨（25kg袋装,骨粉为原料制备）、上海东海制药厂生产的生化试剂蛋白胨(500g瓶装,鱼类蛋白质水解物) 和细菌学F403蛋白胨(250g瓶装，药用带鱼粉为基质酶水解而成)；酵母浸出粉，上海冠生园添加剂制品有限公司生产；麦芽糊精，甘肃张掖龙源食品有限责任公司生产。

1.2  菌种

产气荚膜梭菌B型（C58—2）、D型（C60—2），腐败梭菌（C55—1）由中国兽医药品监察所提供。

1.3  培养基

自行设计，厌氧菌基础培养基Ⅰ含蛋白胨、酵母浸出粉、糊精、葡萄糖、亚硫酸钠、硫代乙醇酸钠、无机盐等,用NaOH调pH至8.0～8.5，116℃30min高压灭菌即可；厌氧菌基础培养基Ⅰ添加M等生长因子组成厌氧菌基础培养基Ⅱ。肉肝胃酶消化汤培养基，按《中华人民共和国兽用生物制品规程》（以下简称《规程》）介绍的方法配制^[1]。

1.4  实验动物

昆明（KM）小鼠，16—20g，由新疆天康畜牧生物技术股份有限公司生物制品事业部动物室自繁自养；新西兰白兔，1.5—2.0kg，购于新疆地方病研究所动物中心。

1.5  试验方法

1.5.1 细菌的培养  按《规程》方法将细菌接种于各种不同的试验培养基中培养，经对比试验优化培养基营养组分。

1.5.2  毒素或毒力测定  按《规程》方法进行。

1.5.3  疫苗配制与成品检验  按《规程》进行。快疫采用攻毒法效检，猝狙、痢疾、肠毒血症采用免疫血清中和毒素法效检。

2  结  果

2.1 设计的厌氧菌基础培养基Ⅰ中，Zn²⁺、Mg²⁺离子对细菌生长和产毒的影响

厌氧菌基础培养基Ⅰ中（使用细菌学F403蛋白胨，含L-半胱氨酸盐酸盐），通过添加MgSO₄和ZnSO₄的比较试验结果说明，产气荚膜梭菌B型，在含Mg²⁺培养基中比含Zn²⁺培养基中的毒力略高。产气荚膜梭菌D型在含Mg²⁺和含Zn²⁺培养基中其产生毒素的能力相同。腐败梭菌在含Zn²⁺培养基中的毒力比含Mg²⁺培养基中的毒力要高，含Mg²⁺培养基没有没有达到《规程》规定的最小致死量标准。

表1  厌氧菌基础培养基I中添加Zn²⁺、Mg²⁺离子对细菌产毒的影响

 

注：①攻毒剂量单位为ml;②表中分数表示注射后24h内的小鼠死亡数/注射数。以下同。

2.2  厌氧菌基础培养基Ⅰ中L-半胱氨酸盐酸盐对细菌生长和产毒的影响

厌氧菌基础培养基Ⅰ中（使用细菌学F403蛋白胨、含Zn²⁺离子），通过L-半胱氨酸盐酸盐添加与否的比较试验，观察其对细菌产毒的影响，见表2.试验结果说明，在培养基中L-半胱氨酸盐酸盐的添加对各细菌产毒促进作用不明显，两组测毒结果相同。

表2 厌氧菌基础培养基 I中添加 L一半胱氨酸盐酸盐对细菌产毒的影响

 

2.3  厌氧菌基础培养基Ⅰ中不同品质蛋白胨对细菌生长和产毒的影响

厌氧菌基础培养基Ⅰ中（含Zn²⁺离子），通过使用不同品质的蛋白胨培养细菌后的产毒结果，见表3 ，可见使用生化试剂蛋白胨和细菌学F403蛋白胨培养基培养的各细菌产生的毒力相差不大，均可达到规程规定的相应标准，但与肉肝胃酶消化汤相比，略显差异。使用海豚牌袋装骨粉蛋白胨培养的细菌产生毒力较差，除产气荚膜梭菌D型外，产气荚膜梭菌B型和腐败梭菌均未达到《规程》规定的毒力标准。

表3 厌氧菌基础培养基 I中使用不同品质蛋白胨对细菌产毒的影响

 

 

2.4  厌氧菌基础培养基Ⅰ中葡萄糖的添加量对细菌生长和产毒的影响

厌氧菌基础培养基Ⅰ中（含Zn²⁺离子，蛋白胨为生化试剂蛋白胨）葡萄糖的添加量对产气荚膜梭菌D型、B型和腐败梭菌的产毒影响不大，在添加0.2—1%范围内，培养的细菌均能良好产毒，达到《规程》规定的毒力标准。结果见表4

表4 厌氧菌基础培养基 I中葡萄糖的添加量对细菌产毒的影响

 

 

2.5  厌氧菌基础培养基中添加生长刺激因子M等（厌氧菌基础培养基Ⅱ）对细菌生长和产毒的影响

厌氧菌基础培养基Ⅰ（含Zn²⁺离子，蛋白胨为袋装海豚牌骨粉蛋白胨）中添加一种生长刺激因子M组成的培养基，我们称其为厌氧菌基础培养基Ⅱ。用此培养基无论是培养产气荚膜梭菌D型、B型还是培养腐败梭菌，它们产生的毒素或毒力，均达到《规程》规定的最高毒力标准。结果详见表5。

表 5 厌氧菌基础培养基 Ⅱ中细菌产毒结果

 

 

2.6 厌氧菌基础培养基Ⅱ中糊精对产气荚膜梭菌B型生长和产毒的影响

在厌氧菌基础培养基Ⅱ中，糊精可以起到提高产气荚膜梭菌B型产毒素的能力。在有糊精的情况下，无论是含葡萄糖0.3%还是0.5%的培养基，攻击毒素剂量0.001ml，均2/2致死KM小鼠；无糊精的培养基，无论葡萄糖0.3%还是0.5%，攻击毒素剂量0.001ml，只1/2致死KM小鼠，低于前者水平。攻击毒素剂量0.002ml时，培养基无论含与不含糊精，各组均2/2致死KM小鼠。见表6。

表 6 厌氧菌基础培养基 Ⅱ中糊精对产气荚膜梭菌 B型产毒的影响

 

2.7  厌氧菌基础培养基培养细菌菌液配制的羊三联四防苗检验结果

使用研制的厌氧菌基础培养基培养的毒力达到《规程》规定的细菌菌液按配制3批疫苗，并进行检验，3批疫苗的无检、安检和效检均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》^[2]的规定。见表7

表7 厌氧菌基础培养基 I和培养基 Ⅱ培养细菌菌液配制的三联四防苗检验结果

注： 血清中和试验动物为K M小鼠， 攻毒试验动物为家兔， 对照均2／2死亡； 腐败梭菌 1 MLD为0.6 m L 。

3  讨  论

由于厌氧菌自身缺乏有氧代谢必备的各种酶，如细胞色素和细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶以及超氧化物歧化酶，造成自身代谢的缺陷，无法进行有氧代谢，而无氧酵解所产生的能量不足，所以厌氧菌在正常大气环境下即不能生长又不能存活，要求的生长条件比较特殊。为使厌氧菌能正常生长，必须制备营养成分丰富，氧化还原电势较低，具有特殊生长因子的专用培养基。通常用心、脑或其它脏器浸液配制厌氧菌培养基，并加入硫乙醇酸钠、美蓝、刃天青、氨基酸、葡萄糖、肝块、肉渣、还原铁、脱脂棉或少量活性炭等还原剂和除氧材料^[3]。《规程》中用于厌氧菌培养生产疫苗的培养基主要有厌气肉肝汤、多蛋白胨牛心汤培养基、厌气肉肝胃酶消化汤、鱼肉胃酶消化汤肉肝汤、肉渣培养基等，培养基类型复杂，制造工艺烦琐，成本高。

厌氧梭菌的类毒素具有很好的免疫原性，其疫苗的质量除与细菌本身的产毒能力（遗传特性）有关外，还与培养方法和厌氧产毒培养基密切相关^[4]。产毒素强的培养基，制造出的疫苗效力就好，因此，我们可以用培养基产生毒素（毒力）的强弱作为选择培养基的标准之一。

我们设计的厌氧菌基础培养基分为三个系统，即厌氧系统（提供较低的氧化还原电势）、营养系统（提供促进生长代谢的基础物质，碳原、氮源、生长因子等）和辅助系统（即维持良好的厌氧环境，又提供营养成分）。厌氧系统采用添加还原剂亚硫酸钠、硫乙醇酸盐、葡萄糖（厌氧与营养双重作用）等，使培养基保持较低的氧化还原电势，以保证厌氧菌生长的良好环境；营养系统采用添加蛋白胨、酵母浸出粉和矿物质等，使培养基含有较丰富的胨、肽、氨基酸、维生素等营养成分，利于细菌生长繁殖和产毒；辅助系统采用添加糊精起到增加培养基的粘稠度，减少液体培养基中氧的溶解并可作为葡萄糖被利用后的后续碳源而被吸收利用的作用。所选原材料，均为成本较低的市售生物和化学试剂。经对产气荚膜梭菌B型、D型和腐败梭菌的培养试验证明，产气荚膜梭菌D型无论在培养基Ⅰ还是Ⅱ中，所有培养物所产毒素结果均达到规程规定的0.0005 ml致死KM小鼠的高标准，在疫苗的生产中采用廉价的厌氧菌基础培养基Ⅰ，完全可以达到厌气肉肝胃酶消化汤的培养标准，而原料成本仅为其21%。在筛选优化成分的厌氧菌基础培养基Ⅰ中添加一种生长刺激因子（M）成为厌氧菌基础培养基Ⅱ，对产气荚膜梭菌B型和腐败梭菌的培养效果也达到了《规程》规定的最高产毒标准，产气荚膜梭菌B型毒素0.001 ml和腐败梭菌菌液0.01 ml致死KM小鼠，原料成本也仅为厌气肉肝胃酶消化汤的27%。

试验中还发现，在我们设计的培养基中，Zn²⁺对腐败梭菌的毒力表达具有促进作用，而Mg²⁺似乎对产气荚膜梭菌B型的产毒效果较佳。厌氧菌培养中通常添加的可促进细菌生长繁殖的生长刺激因子L-半胱氨酸盐酸盐在我们的试验中对细菌产毒没有明显效果。葡萄糖的添加量在0.2-1%范围内对细菌产毒的增加影响不大。培养基中糊精的添加，对细菌的产毒有利。在厌氧菌基础培养基Ⅱ中均使用袋装骨粉蛋白胨，效果与生化试剂蛋白胨和细菌学F403蛋白胨相同，然而，价格却相当于它们的1/20，在羊三联四防苗的大生产中，降低成本产生的经济效益十分显著。

另外，我们还进行了培养基中活性炭的添加试验，结果证明对促进产气荚膜梭菌B型、D型和腐败梭菌的生长繁殖和产毒没有明显效果。

实验试制的三批疫苗经检验，均达到《中华人民共和国兽用生物制品质量标准》的标准，目前已在大生产中广泛使用，效果进一步得到验证。说明我们研制的厌氧菌培养基培养的产气荚膜梭菌和腐败梭菌所产毒素等抗原成分的免疫原性良好。

试验证明，我们研制的厌氧菌基础培养基Ⅱ可以作为产气荚膜梭菌B、D型和腐败梭菌通用的优良产毒培养基，成本仅略高于厌氧菌基础培养基Ⅰ；对于产气荚膜梭菌D型的培养，厌氧菌基础培养基Ⅰ和厌氧菌基础培养基Ⅱ没有明显差别，生产中完全可以使用厌氧菌基础培养基Ⅰ。上述培养基成本低廉，产毒效果稳定，配制方法简单（省去购肉、冷库保存、剔选、绞碎、保温消化、提清过滤等工序，市售生物化学试剂依次添加溶解即可），质量稳定可靠，还可节省人工，缩短生产周期。它们不仅可以应用于厌氧菌疫苗的生产，对于厌氧菌病的疾病诊断和研究都有重要的实际意义。

参考文献

〔1〕 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国兽用生物制品规程二OOO年版[S]. 北京：化学工业出版社.48-51.

〔2〕 中华人民共和国农业部. 中华人民共和国兽用生物制品质量标准二OO一年版[S]. 北京：中国农业科技出版社.33-34．

〔3〕 微生物培养基的制造与应用[M]。陈天寿主编，中国农业出版社. 5-6.

〔4〕 T Shimizu, A Okabe, J Mingani, et al. An upstream regulatory sequence stimulates expression of the perfingosin O gene of Clostridium perfringens[Ｊ]．Infection and immunity. 1991,59:137～142．

〔5〕 蒋玉文,王泰健,屠伟英，等. 羊快疫、猝狙(或羔羊痢疾)、肠毒血症灭活疫苗复合培养基的研究[J].  中国兽药杂志，1994年（第28卷）第1期，3-8。

作者简介  黄炯，男，1963年生，新疆畜牧科学院兽医研究所传染病室副主任，副研究员，从事预防兽医学和生物制品学研究。邮编830000，电话4844134，传真4844630，E-mail：huangjQxj.cninfo.net