沙门氏菌检验（4）
录入时间:2010-9-20 8:22:01
来源：青岛海博
三、培养基
（一）缓冲蛋白胨水
成分：蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O） 9g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
pH7.2
按上述成分配好后，装入大烧瓶，121℃高压灭菌，临用时无菌分装每瓶225mL，供沙门氏菌前增菌用。
（二）氯化镁孔雀绿（MM）增菌液
成分：甲液：胰蛋白胨 5g
氯化钠 8g
磷酸二氢钾 1.6g
蒸馏水 1000mL
乙液：氯化镁（化学纯） 40g
蒸馏水 100mL
丙液：0.4％孔雀绿水溶液
制法：分别按上述成分配好，121℃高压灭菌15min备用，临用时取甲液90mL，乙液9mL，丙液0.9mL，以无菌操作混合即可。
（三）四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液
成分：多胨或月示胨 5g
胆盐 1g
碳酸钙 10g
硫代硫酸钠 30g
蒸馏水 1 000mL
制法：将上述各成分加入蒸馏水，加热溶解，分装每瓶100mL中加入碘溶液2mL，0.1％煌绿溶液1mL。
碘溶液配制：碘6g，碘化钾5g，蒸馏水20mL。
（四）亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液
成分：蛋白胨 5g
乳糖 4g
亚硒酸氢钠 4g
磷酸氢二钠 5.5g
磷酸二氢钾 4.5g
L－胱氨酸 0.01g
蒸馏水 1 000mL
制法：将除亚硒酸氢钠和L－胱氨酸以外的各成分溶解于900mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷备用，另将亚硒酸氢钠溶解于100mL蒸馏水中，加热煮沸，俟冷，以无菌操作与上液混合。再加入1％L~胱氨酸~氢氧化钠溶液1mL。分装于灭菌瓶中，每瓶100mL，pH应为7.0±0.1。
1％L-胱氨酸-氢氧化钠溶液的配法：称取L-胱氨酸0.1g（或DL-胱氨酸0.2g），加1N氢氧化钠1.5mL，使溶解，再加入蒸馏水8.5mL即成。
（五）亚硫酸铋琼脂（BS）
成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 5g
葡萄糖 5g
硫酸亚铁 0.3g
磷酸氢二钠 4g
煌绿 0.025g
柠檬酸铋铵 2g
亚硫酸钠 6g
琼脂 18~20g
蒸馏水 1000mL
pH7.5
制法：将前5种成分溶解于300mL蒸馏水中，将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠另用50mL蒸馏水溶解，将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，冷至80℃，将以上三液合并，补充蒸馏水至1000mL，校正pH，加0.5％煌绿水溶液5mL摇匀，冷至50~55℃倾注平板。
注：此培养基不需高压灭菌，制备过程中不宜过分加热，以免降低其选择性，应在临用前一天制备，贮存于室温暗处，超过48h，不宜使用。
（六）DHL琼脂（Deoxycholate Hydrogen Sulfide Lactose Agar）
成分：蛋白胨 20g
牛肉膏 3g
乳糖 10g
蔗糖 10g
去氧胆酸钠 1g
硫代硫酸钠 2.3g
柠檬酸钠 1g
柠檬酸铁铵 1g
中性红 0.03g
琼脂 18~20g
蒸馏水 1000mL
制法：除中性红和琼脂以外的成分溶解于400mL蒸馏水中，校正pH为7.3，再将琼脂于600mL蒸馏水中煮沸溶解，两液合并，加入0.5％中性红水溶液6mL，待冷至50~55℃倾注平板。
（七）HE琼脂（Hektoen Enteric Agar）
成分：月示胨 12g
牛肉膏 3g
乳糖 12g
蔗糖 12g
水杨素 2g
胆盐 20g
氯化钠 5g
琼脂 18~20g
蒸馏水 1000mL
0.4％溴麝香草酚蓝溶液 16mL
Andrade指示剂 20mL
甲液 20mL
乙液 20mL
pH7.5
制法：将前7种成分溶解于400mL蒸馏水内为基础液，将琼脂加入于60mL蒸馏水内，加热溶解，加入甲液和乙液于基础液内，校正pH，再加入指示剂，并与琼脂合并，待冷至50~55℃倾注平板。
注：①此培养基不可高压灭菌。
②甲液的配制：
硫代硫酸钠 34g
柠檬酸铁铵 4g
蒸馏水 100mL
③乙液的配制：
去氧胆酸钠 10g
蒸馏水 100mL
④Andrade指示剂：
酸性复红 0.5g
1N氢氧化钠溶液 16mL
蒸馏水 100mL
将复红溶解于蒸馏水中，加入氢氧化钠溶液，数小时后中复红褪色不全，再加氢氧化钠溶液1~2mL。
（八）SS琼脂
1. 基础培养基
成分：牛肉膏 5g
月示胨 5g
三号胆盐 3.5g
琼脂 17g
蒸馏水 1000mL
制法：将牛肉膏、月示 胨和胆盐溶解于400mL蒸馏水中，将琼脂加入于600mL蒸馏水中，煮沸，使其溶解，再将两液混合，121℃高压灭菌15min，保存备用。
2. 完全培养基
成分：基础培养基 1000mL
乳糖 10g
柠檬酸钠 8.5g
硫代硫酸钠 8.5g
10％柠檬酸铁溶液 10mL
1％中性红溶液 2.5mL
0.1％煌绿溶液 0.33mL
制法：加热溶化基础培养基，按比例加入上述染料以外的各成分，充分混合均匀，校正pH至7.0，加入中性红和煌绿溶液，倾注平板。
注：① 制好的培养基宜当日使用，或保存冰箱内于48h内使用。
② 煌绿溶液配好后应在10d以内使用。
③ 可以购用SS琼脂的干燥培养基。
（九）三糖铁琼脂
成分：蛋白胨： 20g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
蔗糖 10g
葡萄糖 1g
氯化钠 5g
硫酸亚铁铵[Fe（NH4）2（SO4）2·6H2O]0.2g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12g
酚红 0.025g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
制法：将除琼脂和酚红以外的各成分溶解于蒸馏水中，校正pH，加入琼脂煮沸溶化，加入0.2％酚红水溶液12.5mL，摇匀，分装试管，121℃高压灭菌15min，放置高层斜面备用。
（十）蛋白胨水（靛基质试验用）
万分：蛋白胨（或胰蛋白胨） 20g
氯化钠 5g
蒸馏水 1000mL
pH7.4
制法：按上述成分配制，分装小试管，121℃高压灭菌15min。
靛基质试剂：
柯凡克试剂：将5g对二甲氨基苯甲醛溶于75mL戊醇中，然后缓慢加入浓盐酸25mL。
欧-波试剂：将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95％酒精内，然后缓慢加入浓盐酸20mL。
试验方法：接种培养物36±1℃培养1~2d，加柯凡克试剂约0.5mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色。或加欧-波试剂约0.5mL，沿管壁下覆盖于培养基表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。
注：蛋白胨中应含有丰富的色氨酸，每批蛋白胨应先用已知菌种鉴定后方可使用。
（十一）尿素琼脂（pH7.2）
成分：蛋白胨 1g
氯化钠 5g
葡萄糖 1g
磷酸二氢钾 2g
0.4％酚红溶液 3mL
琼脂 20g
蒸馏水 1000mL
20％尿素溶液 100mL
pH7.2
制法：将除尿素和琼脂以外的成分配好，校正pH，加入琼脂煮沸溶化，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min，冷至50~55℃加入经除菌过滤的尿素溶液，分装于灭菌试管内，放成斜面备用。
试验方法：接种培养物36±1℃培养24h，观察结果，尿素酶阳性者，由于产碱而使培养基变为红色。
（十二）氰化钾（KCN）培养基
成分：蛋白胨 10g
氯化钠 5g
磷酸二氢钾 0.225g
磷酸氢二钠 5.64g
蒸馏水 1000mL
0.5％氰化钾溶液 20mL
pH7.6
制法：将除氰化钾以外的成分配好，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min，放在冰箱内使用其充分冷却，每100mL培养基加入0.5％氰化钾溶液2mL（最后浓度为1:10000），分装灭菌试管，每管约4mL，立刻用灭菌橡皮塞塞紧，放4℃冰箱保存，同时将不加氰化钾的培养基作为对照培养基，分装试管备用。
（十三）氨基酸脱羧酶试验培养基
成分：蛋白胨 5g
酵母浸膏 3g
葡萄糖 1g
蒸馏水 1000mL
1.6％溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
L-氨基酸或DL氨基酸 0.5或1g/100mL
制法：除氨基酸以外的成分加热溶解后，分装每瓶100mL，分别加入各种氨基酸：赖氨酸、精氨酸和鸟氨酸。L-氨基酸按0.5％加入，DL-氨基酸按1％加入，校正pH至6.8，对照培养基不加氨基酸，分装于灭菌的小试管内，每管0.5mL，上面加一层液体石蜡，115℃高压灭菌10min。
试验方法：接种培养物于36±1℃培养18~24h，观察结果，氨基酸脱羧酶阳性者，由于产碱培养基应呈绿色，阴性者无碱性产物，但因葡萄糖产酸而使培养基变为黄色，对照管应为黄色。
（十四）糖发酵管
成分：牛肉膏 5g
蛋白胨 10g
氯化钠 3g
磷酸氢二钠 2g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
pH7.4
制法：葡萄糖发酵管按上述成分配好后，按0.5％加入葡萄糖，分装于有倒管的试管内，121℃高压灭菌15min。其他各种糖发酵管，可按上述成分配好后分装好后分装每瓶100mL，121℃高压灭菌15min，另将各种糖类分别配成10％溶液，同时高压灭菌，将5mL糖溶液加入于100mL培养基内，以无菌操作分装小试管。
注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。
（十五）ONPG培养基
成分：邻硝基酚β-D半乳糖苷（O~nitrophenyl
β-D-galactopyranoside ONPG） 60mg
0.01mol/L磷酸钠缓冲液（pH7.5） 10mL
1％蛋白胨水（pH7.5） 30mL
制法：将ONPG溶于缓冲液内，加入蛋白胨水，以过滤法除菌，分装试管，每管0.5mL，用橡皮塞塞紧。
试验方法：由琼脂斜面上挑取培养物1满环接种，于36±1℃培养1-3h或24h观察结果，如果β-半乳糖苷酶产生，由于1-3h变黄色，如无此酶则24h不变色。
（十六）半固体琼脂
成分：蛋白胨 1g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.35~0.4g
蒸馏水 100mL
制法：按上述成分配好，煮沸溶解，校pH为7.4，分装小试管，121℃高压灭菌15min，直立疑固备用。
（十七）缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和V-P试验用）
成分：磷酸氢二钾 5g
多胨 7g
葡萄糖 5g
蒸馏水 1000mL
pH7.0
制法：溶化后校正pH，分装试管，每管1~2mL，121℃高压灭菌15min。
甲基红试验：接种培养物于36±1℃培养2~4天，滴加试剂一滴，立即观察结果，鲜红色为阳性，黄色为阴性。
甲基红试剂配法：10mg甲基红溶于30mL乙醇中，然后加入20mL蒸馏水。
V-P试验：接种培养物于36±1℃培养2~4天，加入6％α-萘酚酒精溶液0.5mL和40％氢氧化钾溶液0.2mL，充分振摇观察结果，阳性者立刻或数分钟呈红色，如阴性时应于36℃培养4h再进行观察。
（十八）丙二酸钠培养基
成分：酵母膏 1g
硫酸铵 2g
磷酸氢二钾 0.6g
磷酸二氢钾 0.4g
氯化钠 2g
丙二酸钠 3g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液 12mL
蒸馏水 1000mL
pH6.8
制法：先将酵母浸膏和盐类溶解于水，校正pH后再加指示剂，分装试管，121℃高压灭菌15min。
接种培养物于36±1℃培养48h，阳性者由绿色变为蓝色。
（十九）氧化酶试验
1％盐酸二甲基对苯二胺溶液：小量新鲜配制，于冰箱内避光保存。
1％α-萘酚乙醇溶液。
试验方法：取白色洁净滤纸沾取菌落，加盐酸二甲基对苯二胺溶液一滴，阳性者呈现粉红色，并逐渐加深，再加α-萘酚溶液一滴，阳性者于半分钟内呈现鲜蓝色，阴性于2min内不变。
以毛细吸管吸取试剂，直接滴加于菌落上，其显色反应与以上相同。
（二十）WS琼脂
成分：
月示胨 12g
牛肉膏 3g
氯化钠 5g
乳糖 12g
蔗糖 12g
十二烷基硫酸钠 2g
琼脂 15g
Andrade指示剂 20mL
0.4％溴麝香草酚蓝溶液 16mL
甲液 20mL
蒸馏水 1000mL
pH7.0
制法：
除指示剂和甲液外，将其他成分加热溶解，不需消毒，校正pH后加入指示剂和甲液，倾注平板，应呈草绿色。
注：①供沙门氏菌分离用。
②Andrade指示剂和甲液的配制均见HE琼脂。
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