环境中微生物的检测（2）

1.2水体中的微生物

水体可分为天然水体和人工水体。天然水体包括海洋、江河、湖泊等；人工水体包括水库、运河、城市排水系统、各种污水处理系统等。水体中含有微生物所需的各种营养，因而也是微生物的天然生境。水体中微生物除天然栖息者外，还有来自土壤、空气、动植物残体、动物排泄物、各类工业废水和生活污水中的微生物，其中包括某些病原微生物。

1.2.1水中微生物的种类、分布

由于各水域中营养物质的组成、浓度、水温、溶解氧的差异及微生物的来源不同，因此其种类、数量差异很大。

1.2.1.1 微生物的种类

（1）清水型水生微生物

在洁净的水域中，因营养物较少，微生物数量也较少。在每毫升水中一般只含几十个到几百个细菌，并以自养型种类为主。常见的细菌有绿硫细菌、紫色细菌、蓝细菌、柄细菌、赫色纤毛菌、球衣细菌和萤光假单胞菌等。此外，还有许多藻类（如丝状绿藻、硅藻等）、真菌（水霉菌属和绵霉菌属）、原生动物（如钟虫及其他固着型纤毛虫等）和后生动物（如枝角类、桡足类等）。

（2）腐败型水生微生物

在受到有机物严重污染的水域中，数量较多的是细菌，每毫升水中可达几千万个甚至几亿个，以异养菌为优势。异养菌分解有机物，起重要的净化作用。常见的微生物中，细菌以变形杆菌、产气肠杆菌、产气碱杆菌、等革兰氏阴性无芽孢菌为主，此外还有芽孢杆菌、生孢梭菌、大肠杆菌、粪链球菌、弧菌、螺菌、假单胞菌，有的甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱等病原体；藻类有绿藻、裸藻等；原生动物有草履虫、屋滴虫、小口钟虫等。

1.2.1.2 微生物的分布

影响微生物在水体中分布的因素有：水体类型、污染程度、有机物的含量、溶解氧量、水温、pH及水深等。

微生物在水体中的水平分布规律为：近岸水域中细菌数量较多，离岸越远的地方，微生物越少；底泥中的细菌多于水中的细菌。

微生物在较深较大的静水水域中的垂直分布规律是：在上层水体中（水面下0~10m深处），氧含量较高，主要有好氧细菌（如假单脆菌、柄杆菌、球衣细菌等）、真菌和藻类；中层水体（水深20~30m）主要有光合细菌（如红硫细菌和绿硫细菌）以及厌氧细菌；底层水体中（30m以下及湖底泥），主要有脱硫弧菌属、甲烷杆菌属和甲烷球菌属等厌氧细菌。微生物的数量以5~10m深处为最多，随着深度的增加而减少。

地下水由于经过土壤过滤、有机物缺乏，故含菌量远远少于地面水，在深层地下水中甚至没有细菌。

1.2.2 水的细菌学检测

1.2.2.1 细菌总数（CFU）的测定

细菌总数是将定量水样（原水样或作一定稀释后水样1mL）接种在普通营养琼脂培养基内，于37℃培养24h后观察结果，计数其上长出的细菌菌落数，然后换算求出原水样每mL中所含的细菌数。

其测定步骤和土壤中微生物的分离计数方法基本相同，但须注意：①水样是用无菌采样瓶直接采取水样；②水样接种于营养琼脂培养基中，在37℃下培养24h；

在37℃营养琼脂培养基中能生长的细菌，代表在人体温度下能繁殖的异养型细菌。细菌总数越多，说明水被有机物或粪便污染越重，被病原菌污染的可能性也越大。

在生活饮用水中所测得的细菌总数，除说明水被生活废弃物污染的程度外，还可指示该水能否饮用。可在生活饮用水进行卫生学评价时提供依据。

我国生活饮用水标准（GB5749-85）规定，细菌总数不得超过100个/ml。

一般认为在天然水体中，如10～100个/mL，为极清洁的水；100～1000个/mL，为清洁的水；1000～10000个/mL，为不太清洁的水；10000～100000个/mL，为不清洁的水；大于100000个/mL，为极不清洁的水。

1.2.2.2 大肠菌群的测定

天然水体的细菌性污染主要源于生活污水中的粪便，即水中的病原菌很可能是肠道传染病的病原。通常情况下，水中病原菌的含量极少，而细菌种类却很多，需要耗费大量的人力、物力及复杂的分离培养技术，才能将病原菌一一检测出来。最常见的数量极大的大肠菌群与病原菌同样来自于动物粪便，根据这一点，只要通过检查水样中的指示菌――大肠菌群，即可知道该水体被粪便污染的程度，从而间接推测其他病原菌存在的概率。

大肠菌群是指那些能在37℃下，24~48h之内使乳糖发酵并产酸产气、好氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。主要包括大肠埃希氏菌、产气杆菌、枸橼酸盐杆菌、副大肠杆菌。

大肠埃希氏菌即大肠杆菌是人和温血动物肠道中的正常细菌，兼性好氧的革兰氏阴性、无芽孢、两头钝圆的杆菌，大小0.5~0.8mm×2.0~3.0mm；最适温度37℃，最适的pH为中性；能分解葡萄糖、甘露醇、乳糖等多种碳水化合物，并产酸产气。大肠菌群的各类细菌的生理习性都相似，只是副大肠杆菌不分解或缓慢分解乳糖。在远滕氏培养基（品红亚硫酸钠培养基）或伊红美蓝培养基表面会形成具有特殊现象的菌落，大肠埃希氏杆菌的菌落呈紫红色带金属光泽；枸橼酸盐杆菌的菌落呈紫红或深红色；产气杆菌的菌落呈淡红色，中心色深；副大肠杆菌的菌落则无色透明。这些现象可作为鉴别的依据。

大肠菌群的检验方法有发酵法和滤膜法。发酵法是测定大肠菌群的基本方法，包括初发酵试验、平板分离和复发酵试验三个部分。

（1）初发酵试验

发酵管内装有乳糖蛋白胨液体培养基，并倒置一小倒管。乳糖能起选择作用，因为很多细菌不能发酵乳糖，而大肠菌群能发酵乳糖并产酸产气。为便于观察细菌的产酸情况，培养基内加有溴甲酚紫作为pH指示剂。细菌产酸后，培养基即由原来的紫色变为黄色，溴甲酚紫还能抑制其他细菌如有芽胞的细菌生长。

水样接种于发酵管内，37℃下培养，24h内小倒管中有气体形成，并且培养基混浊，颜色黄，说明水中存在大肠菌群，为阳性结果。对于只产酸不产气的，不能说明是阴性结果，因为在菌量少的情况下，可能延迟至48h后才产气，此时应视为可疑结果。需继续做下面两部分实验，才能确定是否是大肠菌群。既不产酸又不产气的，为阴性结果。

（2）平板分离

平板培养基一般使用远藤氏培养基或伊红美蓝琼脂培养基，前者含有碱性品红染料，在此作为指示剂，它可被培养基中的亚硫酸钠脱色，使培养基呈淡粉红色，大肠菌群发酵乳糖后产生的酸和乙醛立即与品红反应，形成深红色复合物，使大肠菌群菌落变为带金属光泽的深红色。亚硫酸钠还可抑制其他杂菌的生长。伊红美蓝琼脂培养基则含有伊红与美蓝染料，在此亦作为指示剂，大肠菌群发酵乳糖造成酸性环境时，该两种染料即结合成复合物，使大肠菌群产生与远藤氏培养基上相似的、带核心的、有金属光泽的深紫色菌落。

将培养24h后产酸产气或只产酸的发酵管，分别划线接种在平板上。经过37℃培养24h，挑取典型的大肠菌群菌落，进行革兰氏染色，镜验后若呈阴性，则可认为有此类细菌存在。为了更进一步验证，可做下一步实验。

（3）复发酵实验

将染色为革兰氏阴性、无芽胞杆菌的菌落再移植于乳糖培养基中，原理与初发酵试验相同，经24h培养产酸又产气的，最后确定为大肠菌群阳性结果。

根据发酵阳性管的数量，以确定大肠菌群数。

除查表外，也可以用计算法求出大肠菌群数。即根据初发酵的发酵管数、大肠菌群阳性管数及检测水样量，利用数理统计原理，计算出每升水样中大肠菌群的最近似数（MPN）。

上一篇：环境中微生物的检测（1）

下一篇：环境中微生物的检测（3）