水中细菌总数的测定和大肠菌群的检测（2）

1)生活饮用水或食品生产用水的检验：

 

    ①初步发酵试验：

    在2个各装有50mL的3倍浓缩乳糖胆盐蛋白胨培养液(可称为三倍乳糖胆盐)的三角瓶中(内有倒置杜氏小管)，以无菌操作各加水样100mL。在10支装有5mL的三倍乳糖胆盐的发酵试管中(内有倒置小管)，以无菌操作各加入水样10mL。如果饮用水的大肠菌群数变异不大，也可以接种3份100mL水样。摇匀后，37℃培养24h。

    ②平板分离：

    经24h培养后，将产酸产气及只产酸的发酵管(瓶)，分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板(EMB培养基)上，37℃培养18—24h。大肠菌群在EMB平板上，菌落呈紫黑色，具有或略带有或不带有金属光泽，或者呈淡紫红色，仅中心颜色较深；挑取符合上述特征的菌落进行涂片，革兰氏染色，镜检。

 ③复发酵试验：

 将革兰氏阴性无芽胞杆菌的菌落的剩余部分接于单倍乳糖发酵管中，为防止遗漏，每管可接种来自同一初发酵管的平板上同类型菌落1—3个，37℃培养24h，如果产酸又产气者，即证实有大肠菌群存在。

    ④报告：

    根据证实有大肠菌群存在的复发酵管的阳性管数，查表2（或表3），报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

    2)水源水的检验：

    用于检验的水样量，应根据预计水源水的污染程度选用下列各量。

    ①严重污染水：1，0．1，0．01．0．00lmL各1份。

    ②中度污染水：10．1，0．1，0．01mL各1份。

    ③轻度污染水：100，10，1，0．1mL各l份。

④大肠菌群变异不大的水源水：10mLl0份。

表2 大肠菌群检索表（饮用水）

 

 表3 大肠菌群数变异不大的饮用水

 

表4 大肠菌群检索表（严重污染水）

 

 表5大肠菌群检索表（中度污染水）

 

 

 表6大肠菌群检索表（轻度污染水）

 

表7 大肠菌群变异不大的水源水

操作步骤同生活用水或食品生产用水的检验。同时应注意，接种量1mL及1mL以内用单倍乳糖胆盐发酵管；接种量在1mL以上者，应保证接种后发酵管(瓶)中的总液体量为单倍培养液量。然后根据证实有大肠菌群存在的阳性管(瓶)数，查表4、表5、表6或表7，报告每升水样中的大肠菌群数(MPN)。

    附：滤膜法

    滤膜法所使用的滤膜是一种微孔滤膜。将水样注入已灭菌的放有滤膜的滤器中，经过抽滤，细菌即被均匀地截留在膜上，然后将滤膜贴于大肠菌群选择性培养基上进行培养。再鉴定滤膜上生长的大肠菌群的菌落，计算出每升水样中含有的大肠菌群数(MPN)。

    (1)准备工作：

        1)滤膜灭菌：

将3号滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中蒸煮灭菌3次，每次15min。前两次煮沸后需换无菌水洗涤2-3次，以除去残留溶剂。

    2)滤器灭菌：准备容量为500mL的滤器，用点燃的酒精棉球火焰灭菌，也可用121℃高压灭菌20min。

     3）培养：

将品红亚硫酸钠培养基放入37℃培养箱内预温30-60min。

    (2)过滤水样：

    1)用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上贴放于已灭菌的滤床上，轻轻地固定好滤器漏斗。水样摇匀后，取333mL注入滤器中，加盖，打开滤器阀门，在—50kPa压力下进行抽滤。

    2)水样滤完后再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器，用无菌镊子夹取滤膜边缘部分，移放在品红亚硫酸钠培养基上，滤膜截留细菌面向上与培养基完全紧贴，两者间不得留有间隙或气泡。若有气泡需用镊子轻轻压实，倒放在37℃培养箱内培养16-18h。

    (3)结果判定：

    1)挑选符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。

    ①紫红色，具有金属光泽的菌落。

②深红色，不带或略带金属光泽的菌落。

   ③淡红色，中心颜色较深的菌落。

    2)凡是革兰氏阴性无芽胞杆菌，需再接种于乳糖蛋白胨半固体培养基，37℃培养6-8h，产气者，则判定为大肠菌群阳性。

    3)1L水样中大肠菌群数等于滤膜法生长的大肠菌群菌落数乘以3。