希瓦菌生物学特性的实验研究

    基因分型技术的快速发展，为更准确地进行微生物学分类、临床快速鉴定细菌感染、了解病原菌的致病机制以及它们与宿主的关系提供了可能。本文所阐述的希瓦菌属( Shewanella   spp． ) 的分类，就是随着全基因测序研究而不断趋于完善的。该菌的命名曾经历了原本归属于无色棒菌属( Achromobacter  spp．)、假单胞菌属( Pseudomonas  spp．)、异单胞菌属( Alteromonas spp．)也称交替单胞菌属( Rubescens  spp．)、腐败假单胞菌( Pseudomonas  putrefaciens )几个阶段，最终命名为希瓦菌属( Shewanella  spp.)。1998年Shideh根据5S rRNA序列的同源性研究，对希瓦菌属进一步做了种、型的分类。本文主要参照Shideh等报道的分类原则和方法，对分离来自腹泻病人粪便和外环境的13株希瓦菌， 进行了生物学特性的实验研究，现将结果报告如下。 

 

1 材料与方法

 

1.1  实验菌株  5株分离自腹泻病人的粪便，1株分离自病家附近的池塘水，1株分离自病人家苍蝇， 6株分离自病家饲养的禽、 畜粪便( 其中猪粪2株、羊粪3株、 鸡粪1株)， 共计13株。 

 

1.2 分离培养基  腹泻病人的菌株直接由麦康凯平板分离。池塘水经EC肉汤增菌后，由麦康凯平板分离。苍蝇和禽、畜粪便经含新生霉素的mEC肉汤36℃震荡培养6h，分离于CT—SMAC(头孢克肟、亚碲酸钾山梨醇麦康凯)平板 。 

 

1.3   希瓦菌属的鉴定  用bioMerieux公司的ATB半自动细菌鉴定仪-ID32  GN和 Api 20E及Api  20NE试条根据说明书进行鉴定。 

 

1. 4   腐败希瓦菌 ( Shewanella  putrefaciens，SP)和海藻希瓦菌( Shewanella   algae，SA) 的鉴别用Hugh—Leifson  O／F试验培养基，以观察其对糖、 醇氧化分解的能力及在6.5％的盐胨水中和SS琼脂的生长情况和绵羊血琼脂上是否有溶血现象进行属内区分。培养基购自市售的干燥培养基。

 

2   结  果

 

2.1 菌体形态   13株希瓦菌，均为革兰阴性，无芽孢，直杆状或微弯曲的杆菌，大部分单个或偶有

短链状排列。 

 

2.2 生物学特性  该菌为需氧菌，糖代谢类型为氧化型。对营养要求不高，在肉汤培养基中，经36℃培养3～6h呈均匀混浊，18 ~24h液面形成菌膜，继续延长时间后，则管底形成膜状物沉淀。在pH8.4 的碱性胨水中生长良好。在半固体琼脂中显示有动力，表层菌苔呈淡粉红色，但色素不扩散，也不溶于乙醇及氯仿等有机溶剂。在KIA琼脂中产生大量的硫化氢 。在麦康凯琼脂上，形成无色半透明光滑、淡橙色菌落。在CT—SMAC琼脂上形成无色半透明中心略带淡灰色的菌落。在 S S琼脂上部分菌株被抑制，在绵羊血琼脂平板上大部分菌落不溶血。 

 

2.3 生化鉴定结果  根据美国CDC的生物学分类原则，并通过用传统的鉴定方法对13株不同来源的希瓦菌的生物学实验研究，结果其中9株为腐败希瓦菌，4株为海藻希瓦菌，详见表 1 。

使用微生物鉴定系统：ATB -Expression的ID 32GN试条及API 20 NE和20 E同步进行鉴定，其鉴定结果均为腐败希瓦菌，符合率分别为94.7～99.9% ，不能区分希瓦菌的不同种别。 

 

2.4 生物分型  在9株腐败希瓦菌中，生物1型6株，其特性为能氧化分解葡萄糖、蔗糖、麦芽糖，其中还有3株能分解阿拉伯糖，2株分解木糖。在SS琼脂和6.5% 氯化钠胨水中均不生长，在血琼脂平板上不溶血。生物2型3株，突出特征是除能缓慢氧化分解葡萄糖和产生尿素酶外，对其他几种试验的糖类和醇类均不能氧化分解，但是它们都能在SS琼脂上生长、在6.5%氯化钠胨水中不生长，并有部分菌株能利用枸橼酸盐和丙二酸盐，在血平板上不溶血。4株海藻希瓦菌的鉴定结果显示，除能微弱氧化葡萄糖、果糖和核糖外，对其它几种糖、醇均不能氧化，而在SS琼脂和6.5% 氯化钠胨水中均能生长，并能在血琼脂平板上缓慢出现溶血现象。 

 

表 1   13株希瓦菌的生化试验结果

2.5 宿主分布  5株病人菌株中，有3株属于海藻希瓦菌，2株属于腐败希瓦菌的生物2型。8株外环境非人类菌株。有5株属于腐败希瓦菌的生物1型，2株为腐败希瓦菌的生物2型， 另1株自苍蝇分离的菌株被鉴定为海藻希瓦菌。 

 

3 讨  论

 

3.1   希瓦菌的分类  从1941年由 Derby和Hammer首先分离并命名为假单胞菌以来，迄今已有近70年的历史，在70年代曾隶属于假单胞菌属，异单胞菌属也称交替单胞菌，直至1985年， Mac—Donell等将其划定为非发酵菌群中一个独立的属希瓦菌属，DNA的G+C含量为44～54 mol% 。近些年，由于科学家对新希瓦菌种的不断发现，至今希瓦菌属已有21个种。据Shideh等报道，美国疾病预防控制中心( CDC)将希瓦菌属中与人类疾病有关的希瓦菌分为腐败希瓦菌和海藻希瓦菌两个种，而把腐败希瓦菌又分为三个生物型。通过手工生化试验可以完成鉴定。目前广泛用于临床的微生物自动鉴定系统，但大都不能准确用于希瓦菌属中腐败希瓦菌和海藻希瓦菌及亚种间的区分。还有赖于常规的传统方法进行种间的鉴定及分型。 

 

希瓦菌属于非发酵菌群，一般为条件致病菌，但由于抗生素的广泛应用，使病原菌发生了很大变化，由条件致病菌引起的感染日益增多，同时因为宿主的因素，往往也会造成机会感染。近年来见诸于由本菌引起的多起临床感染及病人血液、脓液、尿液、痰液和创伤分 泌物等临床标本中检出该菌的报道，因此希瓦菌引起的感染性疾病应引起临床和微生物学界的高度关注。据Shideh等报道，临床上的分离株有77属于美国CDC分型中的腐败希瓦菌生物2型，同时海藻希瓦菌引起人类的感染也占相当的比重。至于海藻希瓦菌引起人类感染的原因目前还不清楚。通过对希瓦菌的生物学特性及其生物型分型的实验研究，以及本菌引起的感染以及探讨外环境与宿主之间的关系，传染源的追溯都有重要的流行病学意义。