革兰阴性杆菌分科显色培养基的效果评价

革兰阴性杆菌分科显色培养基的效果评价 

卢先雷  潘露   

[摘要] 

目的 为缩短G^-b的鉴定时间，提高报告速度，作者设计了一种集分离鉴定于一体的分科显色培养基NBIIA（negative bacilli isolation and identification agar），评价该培养基对于革兰阴性杆菌分离率和分科鉴定的准确性。

方法  检测NBIIA对肠杆菌科、非发酵菌、弧菌科的菌共39株不同种属的已知细菌的分科鉴定结果与金标准（OF+氧化酶）鉴定结果的一致率；采用（NBIIA+氧化酶）与（OF+氧化酶）对照，NBIIA与MC（麦康凯琼脂）对照，对830份临床标本（大便标本除外）进行检测，统计分离率差异及阳性标本分科鉴定一致率。

结果  三科39株细菌分科鉴定一致率：肠杆菌科90%，非发酵菌100%，弧菌科80%； NBIIA与MC对830份标本G^-b的分离率各为19.9%、19.3%；二者一致率98.0%，（NBIIA+氧化酶）与（OF+氧化酶）对阳性标本中G^-b的分科鉴定一致率97.8% 。

结论  NBIIA的分离效果与传统MC差异不具显著性，但由于集分离鉴定于一体，可不必经过（OF+氧化酶）这一鉴定步骤,有助于革兰阴性杆菌的快速鉴定。

    在引起人类感染的G^-b中，以肠杆菌科、非发酵菌、弧菌科细菌最为多见^[1-3]，但由于这三类细菌形态特征相似，而实际所包含的属、种数量又最为庞大，故鉴定过程繁琐，耗时长易出错，影响了检验报告的速度，很不适应临床的实际需要；而购置自动化仪器无论设备或试剂都较昂贵，使成本大大增加，因而抬高了收费价格，增加了病人负担^[4]。为了解决这一矛盾，作者研制了一种集分离鉴定于一体的G^-b分科显色培养基，可在18h内将细菌分离并鉴定至科，现介绍如下：

1．材料与方法：

1.1 材料：

1.1.1蛋白胨、牛肉膏、麦康凯琼脂、氧化酶、微量生化管等购自杭州天和微生物试剂厂，示胨、水解酪蛋白购自英国OXOID公司，糖类、胆盐、各种指示剂、NaCl等稍生物化学试剂为国产试剂。

1.1.2培养基：（1）麦康凯琼脂（MC）：按规定用量配制，调整PH，121℃灭菌后，倾制平皿；（2）G^-b分科显色培养基（NBIIA）：配方：营养琼脂38g、葡萄糖10g、猪胆盐4g、Na₂HPO₄ 6g、KH₂PO₄ 2g、H₂O 1L，加热溶解，调整PH 7.0后加入专用指示剂1ml(可用1%溴甲酚紫1.6ml代替)，煮沸灭菌后倾制平皿（不需高压灭菌）。

1.1. 3菌株:分别来源于卫生部临检中心；四川省临检中心（质控菌株）及临床分离所得（经API复检定种）：

1.1.3.1肠杆菌科（20株）：大肠埃希氏菌、弗氏枸橼酸杆菌、迟缓爱德华菌、产气肠杆菌、阴沟肠杆菌、聚团多源菌、蜂房哈夫尼亚菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯氏菌、臭鼻克雷伯氏菌、摩根摩根菌、奇异变形杆菌、雷极普罗威登菌、伤寒沙门菌、粘质沙雷菌、普城沙雷菌、深红沙雷菌、发光致病杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弗氏耶尔森菌。

1.1.3.2非发酵菌（14株）：铜绿假单胞菌、施氏假单胞菌、产碱假单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌、恶臭假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、腐败许诺旺菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、粪产碱杆菌、脑膜炎败血黄杆菌、产气巴斯德菌、非液化莫拉菌、紫色色杆菌。

1.1.3.3弧菌科（5株）：副溶血弧菌、河弧菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、类志贺邻单胞菌。

1.1.4临床标本：共830份：（1）来自我院住院和门诊病人。标本类型有：痰、尿、脓、宫颈分泌物、精液、前列腺液、咽拭子、血（先增菌）、眼拭子、组织、胆汁、烧伤创面分泌物、胸水（先增菌）、腹水（先增菌）、脑脊液（先增菌）等。（2）由于肠道菌群主要以肠杆菌科为主，弧菌、非发酵菌罕见，故而NBIIA对于大便标本的检测意义不大，应加以排除。

1.2   方法：

1.2.1判断方法与标准：

1.2.1.1NBIIA判断方法：

肠杆菌科：黄色凸起菌落(某些菌属在菌落聚集处呈蓝色)，中心浑浊，直径2.0mm-3.0mm（大）

    非发酵菌：兰色扁平菌落(鲍曼不动杆菌在菌落聚集处由于色素堆积而呈橙黄色，单个菌落无色但不透明)，透明或半透明，直径1.0mm-2.0mm（小）

               弧菌科：淡黄色扁平菌落，干燥不透明，直径1.5mm-2.5mm（大）

1.2.1.2OF+氧化酶判断方法：

肠杆菌科：发酵（F），氧化酶（-）

               非发酵菌：氧化/不利用（O/-），氧化酶（+/-）

               弧菌科：发酵（F），氧化酶（+）

1.2.1.3氧化酶+NBIIA判断方法：

肠杆菌科：黄色凸起大菌落，氧化酶（-）

               非发酵菌：兰色扁平小菌落（鲍曼不动杆菌中等菌落），氧化酶（+/-）

               弧菌科：淡黄色干燥大菌落，氧化酶（+）

1.2.2实验室评价：

采用以上39株已知细菌对NBIIA进行测试，以OF+氧化酶试验作为金标准，比较二者一致率，分别按科进行统计；

1.2.3临床应用试验评价：

1.2.3.1NBIIA与MC平行测试，比较二者对于G^-b的分离率差异；

1.2.3.2NBIIA+氧化酶与OF+氧化酶平行测试，比较二者对于G^-b的分科鉴定一致率。

2.结果：

2.1对39株已知细菌分科鉴定一致率：见表1；

      肠杆菌科一致率：90%，其中沙雷菌属由于红色素干扰，以及生长较快而不易判断；

非发酵菌一致率：100%，其中鲍曼不动杆菌为中等菌落，不透明，其余各菌均为小菌落，透明；

弧菌科一致率：80%，其中气单胞菌由于菌落较大，黄色较深，易判断为肠杆菌。NBIIA与氧化酶联用时可避免误判；

三大科总体一致率：92.3%；

2.2临床应用评价结果：

2.2.1NBIIA与MC对于830份标本分离率比较：见表2

NBIIA分离率：19.9%;MC分离率：19.3%;二者一致率：98.0%; kappa=0.94, P<0.01;

2.2.2NBIIA+氧化酶与OF+氧化酶对G^-B的分科鉴定的比较：

 二者一致率：161/165=97.8%;

表1  39株已知G^-b采用NBIIA与OF+氧化酶鉴定结果

                     表2  NBIIA与MC对830份标本分离率比较

3.讨论：

对临床常见的三大类G^-b的鉴定在以前很长一段时间都是采用传统的双歧表流程操作，虽然鉴定较准确，但繁琐费时，报告时间长，很不适应临床需要。国外从80年代开始推广编码法生化鉴定系统，于90年代引入我国^[5]，近十年来又有酶法生化鉴定系统及在编码法生化鉴定基础上发展起来的自动化仪器使鉴定速度大大加快。但即使如此也仍然跟不上临床感染疾病的迫切需要。现在所采用的编码系统在应用前均应先经分科鉴定，确定科级水平后才能应用相应的编码体系，如此以来从分离培养到编码鉴定之间36~48h的时间几乎很难逾越^[6]，所以解决分科鉴定是缩短整个报告时间的关键所在。而作者根据肠杆菌、非发酵菌、弧菌对葡萄糖分解产酸能力强弱的不同、分解蛋白胨产碱相对产酸量的多少、及此三类细菌对胆盐的耐受能力的大小所研制的这种分科显色培养基集分离鉴定于一体，很好地解决了这一问题^[7-12]，且与传统OF+氧化酶试验有高度一致性。

在该培养基上，有很多细菌菌落形态具有十分独特的特征，如肺炎克雷伯氏菌黄色偏白、黏液型特大菌落（３－５mm），臭鼻克雷伯氏菌为中等大小黄色胶水样菌落，黏液型铜绿假单胞菌的菌落呈透明胶水样，鲍曼不动杆菌在菌落干燥、聚集处由于色素堆积而呈橙黄色，单个菌落无色不透明；阴沟肠杆菌则是天蓝色微黄的大菌落。

   该培养基十分适合与快速酶法生化鉴定系统联合应用，如此可将G^-b的培养、鉴定缩短至24h左右，大大缓解了临床用药与细菌学诊断之间的矛盾，促进了抗生素使用的规范化。且采用该培养基尚可节约一部分生化鉴定试剂，进一步促进医疗经费的节约，缩短病人治疗周期，减轻感染病人病痛，具有一定的经济效益和社会效益。

参考文献

1         张财富.尿液细菌培养及药敏结果分析.上海医学检验杂志,1999,3:153.

2         庞君容.呼吸道及泌尿道感染常见菌及其对抗生素的敏感性分析. 上海医学检验杂志,1997,3:147-148.

3         陈翠玲.儿童下呼吸道感染革兰阴性杆菌的分离及耐药分析.华中医学杂志,1997,1:47.

4         叶应妩,马纪平,李家宏等.我国微生物学检验50年进展.中华医学检验杂志，1999,5:261-263.

5         刘勇.数值鉴定法在肠杆菌科、弧菌科细菌鉴定中的应用.中国医科大学学报,1997,2:187-189.

6   周惠平.临床细菌学检验面临的挑战. 中华医学检验杂志，1999,1:12-14.

7   张军民,周贵民.临床细菌检验快速方法应用进展. 中华医学检验杂志，1998,6:325-328.

8   Trepeta RW,EdbergSC. Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide based medium for rapid isolation and identification of Escherichia coli .J clin microbiol,1984,19:172-174.

9  MerlinoJ,SiarakasS,RobertsonGJ,et al.Evaluation of CHROMagar .Orientation for differentiation and presumptive identification of gram-negative bacilli and Enterococcus species. J clin microbiol,1996,34:1788-1793.

10  Rambach A .New plate medium for facilitated differentiation of salmonellae spp. From proteus spp and other bacteria. Appl Environ microbiol,1990,56:301-303.

11  DushH,AltiveggM. Comparison of Rambach agar ,SM-ID medium ,and Hektoen enteric agar for primary isolation of non-typhi salmonellae from stool samples .J clin microbiol ,1993,31:410-412.

12  InoueK,MikiK,TamuraK, et al .Evaluation of L-pyrrolidonyl peptidase paper strip test for differentiation of membera of the family Enterobacteriaeceae particularly salmonellae spp. J clin microbiol ,1996,34:1811-1812.

上一篇：不同酸性食品种类中常见腐败菌

下一篇：光合细菌在新能源开发中的应用（1）