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蓝细菌制氢研究进展（2）

录入时间:2010-9-28 13:44:05 来源：中国生物工程杂志

蓝细菌产氢的环境条件蓝细菌产氢需要适宜的环境条件，包括光强、温度、盐度、气相组成和培养基营养组成等。对于固氮酶介导的放氢，由于固氮酶活性比最优生长要求更高的饱和光强，适当提高光强往往可以增大产氢。对于异形胞蓝细菌，由于吸氢酶可消耗固氮酶放出的氢，N₂是固氮酶放氢的竞争性抑制剂，O₂可导致可逆氢酶失活，并促进氧氢反应。蓝细菌在空气条件下放氢微弱，难以被检测到，所以蓝细菌放氢一般在氩气环境中进行，或在空气或氮气中补充固氮酶和吸氢酶的气体抑制剂（CO和C₂H₂）进行。另外，添加有机碳化合物往往可以促进放氢，外源氮源的存在则可抑制固氮酶合成和产氢。

固定化培养可以保护蓝细菌细胞及其酶的活性，降低其因受环境条件干扰而导致的失活，从而提高其产氢的速率和稳定性。蓝细菌固定化培养最常用的载体包括琼脂凝胶、藻酸盐凝胶、聚氨酯泡沫和聚乙烯泡沫。Park等在一柱式光生物反应器中采用聚乙烯泡沫固定的A. azollae实现了连续6d产氢，Markov等利用中空纤维固定的A. variabilis实现了5个月连续产氢，产氢速率为0.02-0.2 ml H₂ mg 干重^-1 h^-1。采用连续培养也可以提高蓝细菌产氢的速率和稳定性，Lichtl等［13］采用恒化系统对N. flagelliforme进行连续培养，以利用其在对数生长期较高的固氮酶活性，结果在连续培养条件下产氢速率可达分批培养的4倍之多。

采用某些生理生化方法可以显著促进蓝细菌产氢。异形胞蓝细菌的净放氢是固氮酶放氢和吸氢酶耗氢的结果，提高固氮酶活性或抑制吸氢酶活性都有利于产氢的增加。含钒不含钼的培养条件可以诱导某些蓝细菌表达放氢效率更高的钒固氮酶，从而可以产生更大量的氢气。Dawar等发现在培养基中提高镁离子浓度和添加果糖，Nostoc sp. ARM 411异形胞频率可以增大3倍，其固氮酶活性和产氢能力亦相应提高。蓝细菌吸氢酶辅基中包含镍，镍是吸氢酶合成和具有催化活性的必需组成，采用镍限制条件可以抑制吸氢酶活性，从而显著促进产氢。另外，同步培养也可能成为促进蓝细菌Synechococcus sp.产氢的途径。

一些主要的有利于蓝细菌产氢的策略见表2。

表2促进蓝细菌产氢的策略

环境条件	有利于产氢的策略
光强	适当高于生长所需要的饱和光强
温度	随菌种而异
盐度	随淡水和海洋蓝细菌而不同
pH	6.5-9.0
气相组成	氩气；在空气或氮气中添加CO和C₂H₂
培养基营养组成	添加适当的有机碳化合物；不含结合态氮源；加入一定浓度的VO^3-，不含MoO₄^2-；提高Mg²⁺等金属离子浓度；Ni²⁺限制
菌龄	采用稳定期早期细胞
培养方式	固定化培养；连续培养；同步培养

4菌株筛选和突变株构建

蓝细菌具有广泛多样的生存环境和遗传背景，考察不同生境来源的蓝细菌可能分离获得具有高产氢能力的菌株。不过，筛选高产菌株的研究还不多见。Howarth等比较了9株单细胞不固氮蓝细菌的放氢和吸氢能力。Kumar等分离了11个属20个种的固氮和不固氮蓝细菌，考察了它们的生理特征和在不同条件下的产氢能力。结果发现，Nostoc属和Anabaena属各有1个种表现出依赖于光和固氮酶的好氧产氢能力。在Ar + 1% CO₂下培养时，所有检测菌株均可产氢。3个属（Plectonema、Oscillatoria和Spirulina）的蓝细菌表现出依赖于甲基紫精即依赖于氢酶的产氢能力。

采用化学诱变或基因工程方法，使吸氢酶基因失活，可以使固氮酶放出的氢不被氧化回收，从而提高蓝细菌氢的产率。Mikheeva等采用亚硝基胍诱变方法获得两株A. variabilis ATCC 29413氢代谢缺陷突变株PK84（吸氢酶和可逆氢酶缺陷）和PK17R（吸氢酶缺陷），它们的生长特征和异形胞频率与野生型相同，但放氢速率显著提高。在连续培养PK84和PK17R时，它们产氢的速率分别是野生型的4.3倍和1.4倍，并且在氮营养压力条件下（当N₂由25%下降至5%时），其产氢速率分别达到167.60和59.18μmol H2 mg chl a^-1h^-1。Happe等构建的hupSL缺失的A. variabilis ATCC 29413吸氢酶缺陷株AVM13，在固氮条件下产氢速率显著增大（68μmol H₂ mg chl a-1 h-1），比野生型高3倍。Lindberg等对缺少可逆氢酶的N. punctiforme ATCC 29133采用插入突变构建了hupL突变株，从而获得一不具有任何氢酶的菌株NHM5。将NHM5在固氮条件下培养，可以观察到其能够在空气条件下放氢（14μmol H₂ mg chl a^-1 h^-1），而野生型则不放氢。Masukawa等构建了3株Anabaena sp. PCC 7120的氢酶突变株，即吸氢酶缺陷株hupL、可逆氢酶缺陷株hoxH和双重缺陷株hupL/hoxH，结果发现，hupL和hupL/hoxH突变株产氢量相当，最大产氢速率是野生型的4-7倍，hoxH突变株产氢量则比野生型低15%-33%。他们认为，是吸氢酶基因的破坏，而不是可逆氢酶基因的破坏，促进了Anabaena sp. PCC 7120氢的产生。蓝细菌吸氢酶缺陷突变株的高产氢能力使它们在光生物反应器产氢的研究中获得了应用，其产氢能力亦被进一步证实。

5蓝细菌在光生物反应器中产氢

蓝细菌产氢在光生物反应器中的放大是其走向应用的必经环节。简易高效的光生物反应器的设计是蓝细菌产氢研究的一个重要方面，光生物反应器产氢特征的研究将为蓝细菌大规模产氢提供依据。关于蓝细菌在光生物反应器中产氢已进行了一些很有意义的探索性研究。蓝细菌产氢光生物反应器主要采用管式光生物反应器，另有采用柱式等光生物反应器的报道。反应器培养采用的菌株主要是少数Anabaena属蓝细菌，尤其是A. variabilis及其吸氢酶缺陷突变株PK84。

Tsygankov等采用10 mm内径的聚氯乙烯管制成一实验室规模的4.35 L螺旋状管式光生物反应器，此反应器具备较大的表面积/体积比（200 m^-1）以及良好的生化和环境参数的计算机控制系统，模型实验证明了反应器高速率产氢的可能性。Tsygankov等考察了A. variabilis ATCC 29413及其吸氢酶缺陷突变株PK84在上述管式光生物反应器中分批培养时产氢的特征。Borodin等研究了在此光生物反应器中，在12 h光照（36 ℃）和12 h黑暗（14-30℃）交替进行模拟户外自然条件的情况下，利用A. variabilis PK84产氢的特征，结果PK84在2.5个月连续培养过程中可以稳定产氢，对应于细胞密度3.6-4.6μg chl a ml^-1，最大产氢量为230 ml H₂ 12h光照^-1PhBR^-1。

Fedorov等首次在完全户外条件下在4.35L螺旋状管式光生物反应器中培养A. variabilis PK84。分批培养时，最大产氢速率达到80 ml H₂ h^-1 PhBR^-1，反应器最大光能氢能转化效率在阴天和晴天分别为0.33%和0.14%；连续培养时，产氢速率在36d实验过程中可以维持在25-35 ml H₂ h-1 PhBR-1。Tsygankov等进一步研究了在户外条件下A. variabilis PK84在4.35L光生物反应器中产氢的特征，连续培养时，氢的产量可达1.1LH₂ d^-1 PhBR^-1，最高光能氢能转化效率可达到0.094%。他们发现，产氢速率和光能转化效率主要依赖于温度（在14-30 ℃范围内）和光强，温度提高可明显促进氢的产生和光能转化效率的提高，光强增大对产氢有促进作用，但对光能转化效率有负的影响。这些结果证明了利用A. variabilis PK84在户外自然条件下在光生物反应器中产氢的可能性。

另外，Lindblad等在1.9L计算机控制的管式光生物反应器中连续培养Anabaena PCC 7120及其吸氢缺陷突变株AMC414，结果表明，突变株产氢速率高于野生菌株，它们的最大产氢速率分别为45和20μmol H₂ mg chl a^-1h^-1，突变株在通空气条件下仍可产氢，并且产氢速率随光强增大而增大。他们在4.35L螺旋状管式光生物反应器中在户外条件下培养AMC414，AMC414表现出持续产氢能力，最大产氢为14.9ml H₂ l^-1h^-1,太阳能转化为氢能的最大效率为0.042%。

6结论

利用蓝细菌产氢是理想的生物制氢方式之一。蓝细菌产氢取决于菌株的遗传背景和产氢的环境条件。目前，蓝细菌氢的产率和光能转化效率尚未达到实际应用的要求，但已进行的研究工作为进一步提高蓝细菌产氢的效率奠定了基础。蓝细菌产氢的主要障碍在于：产氢的酶受氧的抑制，产生的氢被吸氢酶消耗，以及氢的产率较低。固氮酶放氢的效率因酶本身的低周转率、高ATP需求和对氧的敏感性而受到严重的影响。另外，篮细菌细胞因适应低光强条件而具有的较高的色素含量，使其在高光强下光合作用效率降低，产氢效率亦降低。提高蓝细菌产氢效率需要在蓝细菌遗传、生理和培养等方面进行深入的研究，这包括分离和研究更多新的蓝细菌，如采用时间分离策略进行光合和固氮的蓝细菌、共生固氮的蓝细菌以及具有异养能力的蓝细菌等，以获得具有更高固氮酶或放氢氢酶活性的蓝细菌菌株；对蓝细菌进行基因工程改造，如使吸氢酶失活、使固氮酶和放氢氢酶对氧稳定和高水平表达、降低细胞色素含量等；以及对产氢培养条件进行优化，包括某些生理调节方式的采用和适宜的光生物反应器的设计。值得注意的是，蓝细菌可逆氢酶在进行催化作用时仅需要较少的代谢能量，在理论上具有比固氮酶更强的放氢能力，蓝细菌可逆氢酶的放氢能力值得深入研究和利用。可以期望，随着对可再生清洁能源的关注，蓝细菌制氢研究将取得迅速进步。

参考文献：略

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