EHEC增菌培养基对O157：H7大肠杆菌增菌效果的观察

观察增菌培养基对 O157：H7 大肠杆菌的增菌效果。以实验室常用方法测定目的菌及非目的菌在增菌培养基中生长的灵敏度及选择性，比较几种培养基对粪便标本中O157：H7的检出率。实验证明，N·m EHEC培养O157：H7大肠杆菌及非目的菌， 出现可见生长的最低接种浓度( cfu／m1)，前者明显小于后者，呈现良好的选择性，对粪便标本中O157：H7的检出率 N·mEHEC明显高于N·mEC。 N · mEC对O157：H7大肠杆菌具有良好的选择性增菌作用，可著提高感染人群和污染标本O157：H7菌的检出率。

O157：H7是肠出血性大肠杆菌的常见血清型，给人类带来的危害是众所周知的，已引起医疗、卫生等部门的高度重视，卫生部下达的“肠出血性大肠杆菌O157：H7的监测方案”明确规定，O157：H7，感染腹泻按《传染病防治法》乙类传染病进行报告和疫情处理。然而，病例的确诊取决于病原学、血清学的检 验结果，直接分离，阳性率极低。到目前为止，国内尚无理想的专用培养基。检索发现，大多采用EC肉汤加新生霉素进行培养，近来又有EHEC菌培养基推出 ，为了更有效地选择增菌培养基，以提高O157：H7，大肠杆菌的检出率，我们应用市售的mEC及 mEHEC 对O157：H7增菌效果进行了实验比较，现报道如下 。 

1 材料

1.1菌株所试27株菌中，1-6号为O157：H7，大肠杆菌(均山梨醇一)，7-16号为普通大肠杆菌，1718号为变形杆菌，l 9-20号为克雷伯菌，21-22号为志贺菌，2324号为沙门菌，25号为柠檬酸杆菌，26号为阴沟杆菌，27号为金黄色葡萄球菌，其中l、5、7、8、9、17、19号为标准菌株，所有菌株均由本站菌种室提供 。

1.2 主要试剂新生霉素为SIGMA公司生产，O157和H7，诊断血清由兰州生物制品研究所和卫生部流研所生产。

1.3 mEHEC培养基：山东省卫生防疫站培养基室提供半成品( 加新生霉素后简称N-mEHEC)，按说明书制备应用。

1.4 mEC培养基：选用两种，分别来自北京和上海两家培养基厂家的半成品 (加新生霉素后分别简称 N- mECj和N- mECs ) 按说明书制备应用。

1.5 其他培养基：普通肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂( MAC)、山梨醇麦康凯琼脂(SMAC)，均为山东省卫生防疫站培养基室生产的半成品，按说明书制备应用。

2 方法

2.1 增菌培养基的比较

2.1.1细菌生长的灵敏度比较

 ( 1 )分别取mECj、mECs及mEHEC培养基半成品，按使用说明配制，后加入相同剂量的新生霉素至培养基最终含量为20mg／L，无菌分装每管备用。

( 2 )将试验菌株37℃ 6h肉汤培养物以无菌生理盐水做10倍系列稀释，并以琼脂平板法测定其浓度(cfu／ m1 )，取 10^-4—10^-85个稀释度各lml×3，分别接种于3种增菌液各1支，37 ℃培养20h后，记录呈现可见生长的最低接种浓度( cfu／m1 )。 

2.1.2 选择性试验

( 1 )分别将1号( O157：H7标准菌株)及8，10，13，16，17，19，26号菌株37 ℃ 6h肉汤培养物以无 菌生理盐水做10倍系列稀释，并以平板法测定细菌浓度( cfu／m1 )。取 1号菌10^-6稀释度2ml ×7分别与 8， 10，13，l6，17，19号菌的10^-3稀释度等量混合，与26号菌10^-4稀释度等量混合，制成O157：H7菌与上述某一菌株的混合菌液。 

( 2 )取上述混合菌液 l ml ×3，分别接种于( 1 ) 所制备3种增菌培养基各1支，充分混匀，于培养前和培养后( 37 ℃2Dh )分别定量划线于鉴别琼脂平板(变形杆菌用MAC平板，其他6株菌用SMAC平板)，培养后计数两种菌落。

2.2对粪便标本增菌效果的比较

 将健康人大便 2g乳化于20ml无菌生理盐水中，并用琼脂平板法测定含菌浓度( cf u／m1 ) 。取该悬液l m l ×12分别接种N· mEHEC、N·mECj、N·mECs各4支。将1菌37℃6h肉汤培养物以无菌生理盐水做10倍系列稀释，并用琼脂平板法测定其浓度(cfu／m1 )，取10^-3 — 10^-6 4个稀释度各 l ml ×3，分别接种含大便悬液的3种增菌培养基各1支，充分混匀，于培养前和培养后( 37℃ 20h ) 各取一菌环( d3mm)划线于SMAC平板，培养后挑选无色菌落，用O157和H7诊断血清做玻片凝集。

3 结果

3.1 三种增菌培养基对细菌生长的灵敏度试验：其中9，12，15，17，18，19，20，22，23，27号菌株，其最大接种浓度( 10⁴— 10⁵ cfu／m1 ) 均未见生长，其他菌株呈现可见生长的最低接种浓度见表 1 。

表 1 三种增菌培养基的比较

注： 表中数字 1m l 接种量呈现可见生长的最低浓度( cfu／m1 ) ，-表示最大接种浓度( 11号为 6×10⁴ ， 13号为9×10⁴ cfu／m 1 ) 仍未见生长 。 

3.2 三种增菌培养基对O157：H7大肠杆菌和非目的菌的选择性试验：增菌前所划各平板生长的非目的菌菌落数为48 —204个，均未检出O257：H7菌，增菌培养后，O157：H7与非目的菌在所划平板上的菌落数见表2。 

表 2 三种增菌培养基选择性增菌效果比较

注： * 增菌前 O 157：H7，大肠杆菌与非目的菌菌量之比；**表中分子为增菌后O157：H 7菌落数，分母为非目的菌菌落数。

3.3对粪便标本增菌效果比较：增菌前经SMAC琼脂分离培养，3种增菌培养基对40份粪便标本O157：H7菌检出率近似，只在 1：90-200 ( O157：H7菌：大便细菌) 时检出37.5％-40％，经37℃ 20h 增菌培养后，检出结果见表3 。 

表 3 三种增菌培养基对 40份粪便模拟标本增菌效果比较

*大便悬液 1m1 ( 各粪便标本平板法计数为5.4×10⁶ —1.2 ×10⁷ cfu/ m1 ) 分别加入O157：H7菌液 6×104、 6×l0³、6×10²、60cfu／ml  各1ml。 

4 讨 论

结果证明，对 O157：H7大肠杆菌增菌效果，依次为N· mEHEC、N.mECj 、N.mECs ；对非目的菌抑菌效果：所试葡萄球菌、变形杆菌、克雷伯菌，在3种培养基中均受到良好抑制，对所试柠檬酸杆菌， 阴沟杆菌均无明显抑菌作用，对普通大肠杆菌，则表现了不同培养基对不同菌株抑菌效果的差异性(见表 1 ) ，以NmEHEC抑菌效果最佳。通过3种培养基对粪便模拟标本的对比检测表明，增菌培养后，其O157： H7，大肠杆菌的检出率，N· mEHEC明显高于两种N mEC(见表3 ) ，而培养前3种培养基只在l：90—200 (O157：H7，菌：大便中非目的菌) 时检出率分别为37.5％、37.5％、40％，三者无显著差异。

进一步检测发现，当3种培养基不加新生霉素时，所试O157：H7，菌株呈现可见生长的最低接种浓度近似，对非目的菌的抑菌效果，除葡萄球菌均被抑制外，只有N．mEHEC对11号、13号大肠杆菌和变形杆菌有不同程度的抑菌作用。当加入新霉素至20 mg／L时，三种培养基除有效地抑制大部分非 目的菌外，对O157：H7，菌的增菌效果出现明显差异( 见表 1 ) ，以NmEHEC增菌效果最佳。

我们在EC肉汤中不加胆盐，只加相同剂量的新生霉素 ( 20mg／L )，则O157：H7菌均受到不同程度的抑制。当胆盐量为1.5g／L时，所试 Ol57：H7菌株生长情况与N · mECs近似；胆盐量增至5g／L时， 与 N·mECj近似；胆盐含量加至8 g／L时，与 N·mEHEC结果近似。由此可见，在一定范围内，适当增加胆盐用量，不仅可有效抑制部分非目的菌的生长，也可减弱或消除新生霉素对 O157：H7的抑菌作用，从而加强对目的菌的增菌效果 。

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