猕猴桃细菌性溃疡病菌检疫技术操作办法
1 主题内容及应检范围
1.1 本办法规定了猕猴桃细菌性溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al. 的检疫检验及检疫处理操作办法。
1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对猕猴桃属Actinidia spp.植物活体、残体的检疫检验和检疫处理。
2 产地检疫
2.1 种苗繁育基地的建立
2.1.1 培育的猕猴桃，应从无病区采集接穗，或用无病虫的当年生半木质枝条作插条。
2.1.2 加强晚秋水、肥管理，避免在强风和冬季低温的高海拔区，即易发生霜冻的地方建园。
2.2 踏查
2.2.1 在种苗繁育基地、猕猴桃栽植地的果园、林场，以自然界线、道路等为单位进行线路（目测）踏查。
2.2.2 调查寄主的主干及分枝上部是否有淡黄色或黄褐色病斑；病斑处是否有小孔，从中向外流出白色或铁锈色液体，病部下方形成深褐色污斑。
2.2.3 调查枝条上是否有暗绿色或暗褐色水渍状纵向、线形龟裂；新梢是否呈暗褐色萎蔫枯死，病部浸出白色水渍状液体。
2.2.4 调查叶片上是否有红色小点，或大小为2–3 mm的褐色多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈，叶片向里或向外翻卷。
2.2.5 确认有疫情需进一步掌握危害情况的，需设标准地（或样方）做详细调查。
2.3 标准地（或样方）调查
2.3.1 种苗繁育基地样方设置与调查
2.3.1.1 样方的累积面积应不少于调查总面积的5%。
2.3.1.2 每块样方面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树5–10株，进行病害分级调查。
2.3.2. 果园标准地设置与调查
2.3.2.1 按果园面积设置，10 hm2以下（含10 hm2）设1块，每增加5 hm2增设1块。
2.3.2.2 每块标准地面积为0.1 hm2，采取棋盘式取样法，抽取样树10株，进行病害分级调查。
2.4 病害分级标准
单株病害分级标准
Ⅰ级 全株叶、蔓无病 代表值0；
Ⅱ级 1–20片叶和1个侧蔓发病，或1/3以下的新梢发病 代表值1；
Ⅲ级 21–30片叶和2–3个侧蔓发病，或1/3–1/2的新梢发病 代表值2；
Ⅳ级 31片以上叶和1–2个主蔓发病，或1/2以上新梢发病 代表值3；
Ⅴ级 主干发病1/3，或多数侧蔓发病、植株部分枯死 代表值4；
Ⅵ级 主干发病1/3，或全部主蔓枯死发病、全株枯死 代表值5。
果园病害分级标准（以被害株率为标准）
轻 被害株率 10%以下；
中 被害株率 11%–30%；
重 被害株率 31%以上。
2.5 所采集的感病材料应包含植物的所有部分和各种症状部分。应尽可能采集感病初期的病株部分，以利于病原细菌的分离。
2.6 样品置于聚乙烯袋内或其它合适容器内保鲜和防止污染。样品应冷藏存放，避免受到阳光的照射。
3 调运检疫
3.1 抽样比例
3.1.1 苗木100株以内（含100株）的应全部检查；100–1000株按10 %抽取；1000株以上按一批货物总件数（株）的5 %抽取。
3.1.2 植株及植株残体应全部进行检查。
3.2 抽样方法
3.2.1 苗木按照抽样比例，采取分层方式设5个样点进行抽样。
3.2.2 对携带有病症的植株及植株残体应全部进行检查。
3.3 现场检验
3.3.1 检查寄主的叶片是否向里或向外翻卷，并有红色小点或多角形病斑，周围有明显黄色水渍状晕圈。
3.3.2 检查1–2 a枝条上是否有水渍状纵向、线形龟裂，新梢是否萎蔫枯死，并有白色水渍状液体溢出。
3.3.3 检查寄主干部是否在病斑下方呈深褐色并有铁锈色液体溢出。
4 检疫检验
4.1 溢菌检验 在具典型症状的病部上，取病健交界处的一小块病组织，在显微镜下切片检查是否有大量细菌液溢出。
4.2 分离培养检验
4.2.1 取小块病斑组织，经表面消毒，灭菌水洗3次后，研碎静置10 min，采用假单孢属选择性培养基进行分离，将分离并经纯化后的细菌移植到BPA培养基斜面上培养48 h，置8 ℃冰箱保存。分离鉴定方法见附录1。
4.2.2 检查在BPA培养基平板上是否形成污白色、圆形、全缘、凸起、光滑、直径约为1–3 mm的菌落；在KBA培养基上未见荧光；在Luisetti培养基上发生蓝色荧光及在SPA培养基上呈粘液状菌落。
4.3 染色检验
4.3.1 鞭毛染色 采用西萨—基尔染色法。经染媒5–7 min→水洗干燥→苯酚品红染色5 min→水洗干燥后镜检。
显微镜下菌体和鞭毛为阴性反应，呈红色，极生1–3根。
4.3.2 革兰氏染色 采用结晶紫草酸胺染色法。经固定涂片→染色1 min→水洗数秒吸干→碘液处理1 min→水洗数秒吸干→褪色30 s→水洗数秒吸干→复染10 min→水洗吸干后镜检。
显微镜下菌体为革兰氏阴性反应，呈红色。
4.4 生理生化检验
4.4.1 生长与温度试验 菌株生长最高温度为35 ℃；最适生长温度为25–28 ℃；致死温度为55 ℃条件下10 min。
4.4.2 精氨酸双水解酶检验 配制Thornley培养基。每试管装3–4 ml培养基灭菌®冷却®针刺接种细菌至培养基底部®立即用灭菌凡士林封管→在27℃条件下培养7 d。
在此条件下，精氨酸双水解酶为阴性，颜色不变。
4.4.3 果聚糖（Levan）试验 用细菌悬浮液，在SPA培养基上，或用葡萄糖代替蔗糖培养基平板上分别划线。在25℃条件下培养3–7 d，形成白色、粘稠、圆顶、隆起而有闪光的菌落为阳性反应。
在此条件下，在SPA培养基上可形成前述菌落，果聚糖试验为阳性；而在用葡萄糖代替蔗糖培养基上，不形成前述菌落。
4.4.4 冰核活性测定 用直径16 mm的螺口试管，装浓度大于168 CFU/ml细菌液3–5 ml，加盖置于–4℃水浴中（水浴含11.2%的食盐水）。如此液在5 min内结冰，表明有冰核活性。
在上述条件下，菌液经测定为无冰核活性。
4.5 碳素化合物的利用和分解
4.5.1 碳素化合物产酸试验 配制Ayers培养基。在适温下放置4–5 d后，每5 ml培养液接种0.1 ml含108 CFU/ml 的菌悬浮液，适温下培养3–4周，产酸时培养液变为黄色。
在此条件下，培养液变为黄色，能利用葡萄糖、棉子糖、山梨糖、蔗糖产酸。
4.5.2 V. P试验（产生3–羟基丁酮试验） 将细菌接种于甲基红试验用培养液，培养2–4 d，按每毫升加40% KOH（含0.3% 肌酸或肌酐）0.1 ml溶液，置48–50℃水浴中，充分摇动2 h，在4 h内观察出现红色为阳性反应。
在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。
4.5.3 甲基红试验（MR试验） 将细菌接种于葡萄糖蛋白胨培养液，适温下培养2–4 d以上，取培养液5 ml，加甲基红试剂2–3滴。培养液变红色为阳性反应，黄色为阴性反应。
在此条件下，培养液测验为阴性反应，呈黄色。
4.6 氮素化合物的分解
4.6.1 硝酸盐还原试验 将硝酸盐半固体培养基用4% NaoH调节pH至7.0–7.2。每支试管分装5–10 ml培养基灭菌，针刺接种细菌。试管培养3、5、7 d后，分别用Griess–Liosvary试剂测定法测定亚硝酸。如呈红色，表示有亚硝酸根为阳性反应。
在此条件下，培养液测验为阴性反应，不呈红色。
4.6.2 吲哚试验
4.6.2.1 配制胰蛋白胨10.0 g、酵母膏5.0 g 、蒸馏水1000.0 ml的培养液，接菌后适温培养。
4.6.2.2 将滤纸剪成小条，在饱和草酸溶液中浸过后取出，灭菌烘干后，夹在棉花塞和管壁之间，使滤纸悬挂在不接触培养液的液面上，有吲哚产生的滤纸变淡红色。
在此条件下，滤纸不变淡红色，不产生吲哚。
4.7 大分子化合物的分解
4.7.1 明胶液化 在BPA培养基中加10%–12%的明胶，每支试管4–10 ml，在121℃灭菌12–15 min，冷却后用穿刺法接菌，在适温中培养3、7、14和21 d，将试管取出置冷水和4℃冰箱中，使明胶凝固，检查明胶是否凝固或液化，并以未接菌的明胶作对照。
在此条件下，该菌株不能使明胶液化。
4.7.2 石蕊牛乳反应 用石蕊牛乳培养液，间歇灭菌3次，每次通蒸气20–30 ml。接种后于28℃条件下培养，以不接种的石蕊牛乳作对照，定期观察4–6周。
在此条件下，石蕊牛乳反应变蓝，示有微碱性。
4.7.3 吐温80的水解 采用Sierra方法测定。将吐温80高压蒸气灭菌后，取10 ml加入蛋白胨10 g、CaCI·2H2O 0.1 g、琼脂17 g、蒸馏水1000 ml，pH 7.4的培养基中，混匀后制成平板，点种细菌，适温培养7 d。如在菌落周围有不透明白色沉淀区出现，表示吐温80被水解，为阳性反应。
在此条件下，吐温80能水解，为阳性反应。
4.8 其它生理生化试验
4.8.1 氧化酶试验 在培养皿内放一张滤纸，滤纸上加3–4滴1%二甲基对苯二胺盐酸盐，使其湿润。用玻棒挑取生长24 h的菌苔涂在滤纸上，若菌苔在10 s内变成紫色，为阳性反应；在60 s以后变色或一直不变色，为阴性反应。
在此条件下，菌苔的氧化酶试验为阴性反应。
4.8.2 过氧化氢酶（接触酶）试验 挑取在固体培养基上生长24–48 h的菌苔，置于干净玻片上，滴加3%的过氧化氢，30 s内有大量气泡产生为阳性，不产气泡为阴性。
在此条件下，菌苔过氧化氢酶试验为阳性。
4.9 致病性测定
4.9.1 烟草过敏性反应
将在26℃条件下，培养72 d的菌株，用无菌水配成3×108 /ml的菌液，对烟草下表皮进行皮下接种，在24 ℃条件下经20–24 h后检查是否出现过敏性坏死斑。
4.9.2 植株致病性测定
将分离菌株接种在植株健叶或休眠枝条上，菌液浓度6×108 /ml。10–15 d后或次年2月下旬到3月下旬，检查是否出现典型叶斑症状，具晕圈；休眠枝条有溃疡症状及菌浓。
根据上述检验结果，对照病原特征，鉴定是否为猕猴桃溃疡病菌Pseudomonas syringae pv. actinidiae Takikawa et al.
5 除害处理
5.1 禁止从疫情发生区调运染疫植物活体。
5.2 发现带疫植株应喷洒1万单位农用链霉素3000倍液、30%琥珀酸铜（DT）胶悬剂200倍液或70% 百菌通 500倍液分2–3次进行处理。
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