鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗制作规程(1)

鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗制作规程 

前   言

 　　为规范鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗制作要求，保证疫苗质量，特制定本标准。

本标准的附录A、附录B为规范性附录。

1　范围

　　本标准规定了鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗(以下简称“疫苗”)制作的术语和定义、技术要求、生产工艺流程、菌种生产、操作规程、发酵生产操作规程、安全性检测、效力检验、产品分装与保存、留样待检。

　　本标准适用于我省鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗的生产。

2　规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。

　　GB 6388 运输包装收发货标志

3　术语与定义

　　下列术语与定义适用于本标准。

　　嗜水气单胞菌灭活疫苗

　　嗜水气单胞菌培养液加入适量的福尔马林溶液，在一定的恒温条件下经适当时间灭活后制成的全菌液。

4　技术要求

　　按附录A的要求执行。

5　生产工艺流程

   原菌种活化 → 菌种扩大培养 →  种子罐培养  →   发酵罐培养  →  灭活 →　安全性检测 →  效力检测 →  产品分装。

6　菌种生产操作规程

6.1　仪器设备和试剂

　　无菌室或超净工作台、灭菌锅、三角瓶、试管、冰箱、恒温培养箱、显微镜、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨和琼脂等。

6.2　培养基制备

　　按如下配方制备培养基：取牛肉膏0.6%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、琼脂2%，将琼脂加热溶化后用0.1mol/L氢氧化钠或盐酸调节pH值为7.0～7.5，然后分装三角瓶或试管，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用。

6.3　菌种活化与扩大培养

6.3.1　菌种来源

　　菌种来源为经系统鉴定的致病性嗜水气单胞菌。

6.3.2　活化与扩大培养

　　在无菌条件下从嗜水气单胞菌原菌种斜面上挑取少量菌苔，置放试管斜面内进行划线，然后置28℃温箱内培养（22～28）h，经检查无杂菌，菌体生长整齐后，从试管斜面挑取菌苔再次重新接种，在28℃温箱内培养（22～28）h，用肉眼观察，如菌苔丰满，无杂菌，则放4℃冰箱中备用。否则重作。

7　发酵生产操作规程

7.1　仪器设备和药品

　　种子罐、发酵罐、显微镜、麦氏比浊管、试管、载玻片、三角瓶、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、牛肉膏、蛋白胨、生理盐水等。

7.2　种子罐培养

7.2.1　培养基

　　按如下配方制备培养基：取牛肉膏0.6%，蛋白胨1%，氯化钠0.5%。混溶后调pH值为7.0～7.5。

7.2.2　空罐灭菌

　　将空发酵罐清洗干净，在0.11MPa压力下灭菌30min。

7.2.3　装料

　　将7.2.1条配方的培养基灌装，投料量不得超过罐容积的70%。

7.2.4　灭菌

   装好料后，在0.11MPa压力下灭菌30min。

7.2.5　接种

　　发酵罐灭菌后冷却致28℃即可接种。在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加（100～500）ml无菌水，把菌苔刮下制成菌悬浮液，含菌量为10CFU/ml。将制好的菌悬浮液，在无菌条件下，按1%的比例接种于冷却至28℃的种子罐内进行培养。

7.2.6　培养条件的控制

　　接种后在温度为28℃，压力为0.05MPa，通气量1∶1（每分钟进出空气体积比）和220r/min搅拌条件下，培养（22～28）h。

7.2.7　培养过程中的检测

7.2.7.1　指标

　　接种后22h开始，每隔2h取样一次检测，包括菌体生长状况、含菌量和pH值，达到如下指标，即可移种至发酵罐内发酵培养。

　　a）菌体生长整齐；

　　b）处于对数生长期；

　　c）含菌量10×10⁸ CFU /ml以上；

　　d）无杂菌污染；

　　e）pH值为7.0～7.5。

7.2.7.2　检测方法

　　a）在无菌条件下，取培养液（50～100）ml，于灭菌三角瓶中，备用；

b）用无菌吸管或接种环取发酵液一滴，置于洁净载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察菌体生长状况，判定是否有杂菌生长；

　　c）含菌量检测　细菌计数采用倾注平板法或用麦氏比浊管估测，麦氏比浊管细菌计数按附录B的方法执行。

7.3　发酵罐培养

7.3.1　培养基配制、灭菌和装料方法同7.2条。

7.3.2　接种

　　在无菌条件下将种子罐的细菌培养液，按1%的比例接种于冷却至28℃的发酵罐内进行培养。

7.3.3　发酵罐培养条件的控制

　　同7.2.6条。

7.3.4　培养过程中的检测

　　接种后22h开始，每隔2h取样一次检测，包括菌体生长状况、含菌量等，当含菌量达到1.0×10⁹ CFU /ml以上（根据生产需要确定菌液浓度），即可对发酵罐内菌液进行灭活。

7.3.5　检测指标与方法

　　同7.2.7条。

7.4　灭活

7.4.1　灭活方法

　　将发酵罐内细菌培养液加入福尔马林，使福尔马林最终浓度为0.15%，在4℃条件下灭活48h或25℃条件下灭活24h。在灭活过程中，每天充分搅拌（2～3）次。灭活后的菌液即为鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗。

7.4.2　无活菌检验

　　在无菌条件下，取10ml灭活后的疫苗，用生理盐水将待检疫苗稀释10倍，吸取0.2ml分别接种到肉汤蛋白胨液体培养基、厌气肉肝汤培养基上各一管，在37℃条件下培养48h，均应无菌生长。如有菌体生长，则为灭活不彻底，为不合格产品。

8　安全性检测

8.1　试验容器

8.1.1　选用容积为（1～2）m³的水泥池或水簇箱等容器。容器需配有控温和通气增氧装置。

8.1.2　容器在使用前用万分之一的漂白粉水溶液消毒24 h，消毒后用自来水冲洗干净，并放入适量经活性碳处理的自来水曝气24h后待用。

8.2　试验鱼种

选用体重为100g左右，体质健壮，游动活泼，无任何损伤和疾病的鲫鱼，在试验前用2%的食盐水浸浴（5～10）min, 将鱼种放入符合8.1条规定的容器中，于（28～30）℃水温下饲养，观察15d，所有鱼均应活动正常。如发现有鱼种出现有细菌性败血症症状，则该批鱼种不得使用。

8.3　安全性试验

取符合8.2条规定的鲫鱼60尾，设实验组和对照组，各30尾鱼。将疫苗用无菌注射器对实验组鱼种作胸腔注射，注射剂量为0.5 ml /尾（疫苗浓度1.0 X10⁹ CFU / ml）。对照组注射等量生理盐水。将鱼种在（25～28）℃水体中饲养，观察15d，如发现实验组鱼患细菌性败血症，而对照组鱼为阴性，则该批疫苗为不合格产品。

9　效力检验

9.1　鱼种免疫

9.1.1　按8.1条规定准备试验容器，按8.2条规定选择试验鱼种。

9.1.2　将符合安全试验的待检样品用无菌生理盐水稀释成含菌量为1.0 X10⁹ CFU / ml，用无菌注射器对鱼种进行免疫注射，每尾腹腔注射剂量为0.3ml，试验鱼种不少于30尾。第三天再用同剂量疫苗强化免疫，注射后的鱼种在（25～28）℃的水温下饲养30d,该批鱼种即为免疫鱼种。

9.2　免疫鱼攻毒

在无菌条件下将试管斜面嗜水气单胞菌苔刮下制成菌悬浮液，含菌量为1.0 X10⁸ CFU /ml。以0.3m L/尾的剂量，分别注射经免疫的试验组鱼种和未经免疫的对照组鱼种（试验组和对照组的鱼种数量相同，每组数量不少于30尾）。攻毒后的鱼种在（25～28）℃的水体中观察15d，记录各组的死亡鱼数，计算死亡率。

9.3　免疫保护率的计算

根据9.2条的试验结果，计算其免疫保护率。

免疫保护率(%)=（对照组鱼种死亡率一试验组鱼种死亡率）/对照组鱼种死亡率×100%

注: 免疫保护率在65%以上的制品为合格品。

10　产品分装与保存

　　将灭活、安全性和效力检测合格的疫苗在无菌条件下，分装于50ml或100ml经消毒处理的玻璃瓶或塑料瓶中，加贴标签，包装产品。产品包装按GB 6388的要求执行。疫苗产品置于4℃环境下冷藏备用，有效期为90d。在疫苗保存期间，应不定期进行无活菌检验，以保障疫苗的安全性。

11　留样待检

　　每批产品留样(3～5)瓶，保存90d。

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