行业标准——磷细菌肥料

  中华人民共和国农业行业标准

磷细菌肥料

Phosphate bacteria fertilizer　               

前 言

本标准在原有标准NY227-1994《微生物肥料》的基础上，对其中的磷细菌肥料部分进行修改。

主要修改内容如下：

—增加术语、抽样和判定规则部分；

—增加菌种部分，包括菌种有效性、菌体特性特征、菌落形态；

—删除成品无害化指标。因为磷细菌肥料一般以草炭为载体，不存在重金属的危害。草炭经高温灭菌后，大肠杆菌和蛔虫卵不再存在。

本标准自实施之日起，同时代替NY227-1994中的磷细菌肥料部分。

本标准的附录A、附录B、附录C、附录D都是标准的附录。

本标准由中华人民共和国农业部提出。

本标准起草单位：农业部微生物肥料质量监督检验测试中心、中国农业科学院土壤肥料研究所。

本标准主要起草人：梁绍芬、姜瑞波、葛诚、李俊、沈德龙。

磷细菌肥料

Phosphate bacteria fertilizer

1 范围

本标准规定了磷细菌肥料产品的分类、技术要求、检验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存等。

本标准适用于含有益磷细菌微生物，能分解土壤中的难溶性磷化物，改善作物磷素营养状况，又能分泌刺激素剌激作物生长发育的活体微生物制品。

2 引用标准

下列标准所包含的条文，通过在本标准中引用而构成为本标准的条文。本标准出版时，所示版本均有效。所有标准都会被修订，使用本标准的各方应探讨使用下列标准最新版本的可能性。

GB/T 6543-1986 瓦愣纸箱

NY 411-2000 固氮菌肥料

3 定义

本标准采用下列定义：

3.1磷细菌肥料

能把土壤中难溶性的磷转化为作物能利用的有效磷素营养，又能分泌激素刺激作物生长的活体微生物制品。

4  产品分类

4.1 按剂型不同分为：液体磷细菌肥料、固体粉状磷细菌肥料和颗粒状磷细菌肥料。

4.2 按菌种及肥料的作用特性分为：有机磷细菌肥料、无机磷细菌肥料。

4.2.1 有机磷细菌肥料：能在土壤中分解有机态磷化物(卵磷脂、核酸和植素等)的有益微生物经发酵制成的微生物肥料。分解有机态磷化物的细菌有芽胞杆菌属中的种(Bacillus sp.)、类芽胞杆菌属中的种(Paenibacillus sp.)。

4.2.2 无机磷细菌肥料：能把土壤中难溶性的不能被作物直接吸收利用的无机态磷化物溶解转化为作物可以吸收利用的有效态磷化物。分解无机态磷化物的细菌有假单胞菌属中的种(Pseudomonas sp.)、产碱菌属中的种(Alcaligenes sp.)、硫杆菌属中的种(Thiobacillus sp.)。

使用本标准规定之外的菌种生产磷细菌肥料时,菌种必须经过鉴定,而且必须为非致病菌菌株。

5 技术要求

5.1 菌种的有效性

用于生产磷细菌肥料的菌种,必须是从国家菌种中心或国家科研单位引进的并经过鉴定对动物和植物均无致病作用的非致病菌菌株；这些菌株在含有卵磷脂或磷酸三钙的琼脂平板上培养,能观察到明显的溶磷圈；发酵培养后解磷量与不接菌对照比较有显著差异（p≤0.05）。

5.1.1 有机磷细菌：芽胞杆菌属的细菌为革兰氏染色阳性，能产生抗热的芽胞，为椭圆形或柱形周生或侧生鞭毛，能运动，能产生接触酶。

5.1.2 无机磷细菌：假单胞菌属中的细菌为革兰氏染色阴性杆菌，极生的单鞭毛或丛鞭毛，能运动，接触酶阳性。此属中的部分菌株为致病菌，必须进行严格的菌种鉴定后才能用于生产。产碱菌属的细菌，细胞呈杆状，1-4根周生鞭毛，能运动，革兰氏染色呈阴性，接触酶阳性。硫杆菌属的菌为革兰氏染色阴性小杆菌，单根极生鞭毛，能运动，严格自养。

5.2 产品技术指标

5.2.1 液体磷细菌肥料技术指标。

5.2.2 固体（粉状）磷细菌肥料技术指标见表2。

表2 固体（粉状）磷细菌肥料技术指标

　 5.2.3 固体（颗粒）磷细菌肥料技术指标见表3。

表3 固体（颗粒）磷细菌肥料技术指标

6 抽样

按每一发酵罐菌液制成的产品为一批，逐批抽样检验。抽样过程要严格避免杂菌污染。6.1 抽样工具及用品

抽样前预先准备好无菌塑料袋(或塑料瓶)、金属勺、剪刀、封口机(或封口胶带)、牛皮纸封样袋、标签、抽样封条和胶水。

6.2 抽样数量及抽样方法

在成品库抽样，按图形分层设点抽样，抽样以件为单位，小包装产品以一包装箱为一件。大包装（30-50kg）产品以一袋（或一桶）为一件。抽样基数由样品基数的大小确定。1-10件，全部抽样。11-200件，抽样10件；201-400件，抽取20件。样品基数大于400件，按照超过部分的2%增加抽样件数。总件数不超过40件。

每件小包装产品抽取一小袋，在无菌条件下每袋取样200g。将所有样品混匀，按四分法缩到2000g，分装4袋，然后封口。每2袋为一份装入牛皮纸封样袋。最后贴上抽样标签和抽样封条（液体肥料小包装亦参照此法进行）。所抽样品一份留存被抽样单位，一份交检测中心检测。

7 检验方法

7.1 仪器设备及试剂

7.1.1 仪器设备

生物显微镜（10×100）；

菌落计数器；

恒温培养箱；

恒温干燥箱；

恒温摇床；

灭菌锅；

无菌室或超净工作台；

酸度计；

试管：ф15mm×150mm，ф18mm×180mm；

培养皿：直径9cm；

三角瓶：500mL；

无菌吸管：1、2、5、10mL；

玻璃刮刀；

滤纸；

酒精灯；

标准筛：孔径0.18mm，2.5 mm，5.0mm；

1号羊毛画笔；

铝盒。

7.1.2 试剂和培养基

7.1.2.1 试剂

蒸馏水；

无离子水；

无菌水。

7.1.2.2 培养基（见附录D）

7.2 成品检验

7.2.1 气味检验

将液体活固体磷细菌肥料的包装打开，用手煽动包装口处的空气，嗅其气味。

7.2.2 外观检验

将固体磷细菌肥料包装打开，置于白色搪瓷盘中，液体肥料摇匀，在明亮的光线下进行观察。

7.2.3 pH值测定

液体磷细菌肥pH值测定：取供检菌液于50mL烧杯中直接用酸度剂测定pH值，取三次测定结果的平均值。

固体磷细菌肥pH值测定：称取供检样品15.0g，置于50mL烧杯中，用量筒取30.0mL蒸馏水，用磁力搅拌使溶液均匀后，用酸度计测定pH值。取三次测定结果的平均数。

7.2.4 含水量测定

称取固体磷细菌肥料三份，每份20.00g，精确到0.01g，放入已称恒重的铝盒中。置105℃干燥箱内烘烤4h，移至干燥器内，冷却后称重。根据烘干前后质量差按式(l)计算含水量。取三个样品测定数的平均值。平行样品绝对偏差应低于1%。

含水量(%)=（m₀-m₁）/m₀×100 ………………(1)

式中：m₀一烘干前样品质量，g

      m₁一烘干后样品质量，g。

7.2.5 吸附剂颗粒细度测定

称样10.00g(精确至0.01g)，置于标准筛中(直径分别为0.18mm和0.15mm)，用水冲洗，用毛笔轻刷，至粉末不再通过为止。将筛余物置105-110℃温度下烘干，称重。筛余物百分含量按式(2)计算：

筛余物(%)=筛余物质量/（1-样品含水量百分数）/样品质量×100 ………(2)

颗粒肥料的粒径称样后直接通过2.5mm和4.5mm的标准筛即可。

7.2.6 磷细菌有效活菌数及杂菌率的测定

采用平板计数法测定磷细菌活菌数及杂菌率。

7.2.6.1 制作肉汤培养基平板和马丁培养基平板（配方见附录D）

7.2.6.2 样品稀释培养及计数

  称取10.00g供检样品，加入带玻璃珠的100mL的无菌水中(液体菌剂取l0mL加入90mL的无菌水中)，在旋转式摇床上200r/min充分振荡30min，静置20min后，即成母液的菌悬液。

  用无菌吸管分别吸取5mL上述母液的菌悬液加入45mL无菌水中，混匀成1：10稀释的菌悬液，这样依次稀释，分别得到1：1×10²，1：1×10³，1：1×10⁴，1：1×10⁵等浓度（每个稀释度必须更换无菌吸管）。

  用0.5mL无菌吸管分别吸取不同稀释度菌悬液0.1mL，加至直径为9cm的含培养基的平板上，用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀地涂于琼脂表面，每个样品取3个连续适宜稀释度，每一稀释度重复3次，同时加无菌水的空白对照。28℃-30℃培养2-5d。在马丁培养基上加入10^-3稀释度菌悬液测定霉菌数。

7.2.6.3 菌落识别及计数

  根据被检产品菌种的菌落特征于杂菌区别开。必要时进行革兰氏染色（见附录A）或芽胞染色（见附录B），在显微镜下观察，取菌落20-300的平板计数。计算出三个重复的有效磷细菌菌落平均数。

  有效磷细菌菌落以外的其他细菌菌落为细菌杂菌菌落数。在马丁培养基上计出霉菌数。有效磷细菌活菌数按式（3）计算：

有效活菌数（个/g）=菌落平均数×稀释倍数×母液菌悬液的体积/菌剂克数或毫升数/加样量 …………………(3)

杂菌率(%)=杂菌总数/（磷细菌数+杂菌总数）×100 …………………(4)

7.2.6.4 磷细菌解磷效能测定

a、平皿定性测定

将有机磷细菌或无机磷细菌培养基融化后冷却至45℃左右倒入灭菌平皿，每皿约15mL左右，凝固后培养基表面无冷凝水后待用。待测菌种活化后加入适量无菌水，刮下菌苔，制成均匀的菌悬液。用灭菌滴管滴入备用的平板上，每皿可均匀地分别滴四个点。待滴入的菌悬液干后才可反转置于28-30℃恒温箱中培养2-3d后观察结果。在菌落周围有透明圈为有溶磷活或解磷作用，无透明圈的为不溶磷、少溶磷，或不解磷、少解磷。

b、钼锑抗比色法定量测定

将磷细菌接种到相应的磷细菌液体培养的三角瓶中，置摇床（200r/min）上保温30℃振荡培养72h。下摇床后加入无磷活性炭脱色高速离心，将上清液倾出待测。用钼锑抗比色法测定有效磷含量（见附录C）。

7.2.7 有效期的检验

在产品说明书标明的有效期到达前10d测定活菌数，活菌数达到标准要求的即为有效期合格。

8 检验规则（判定规则）

8.1 检验分类

8.1.1 产品出厂检验

产品交货时进行的检验。

8.1.2 产品型式检验

新产品鉴定或国家质检机构质量监督检验。

8.2 检验项目

型式检验的检验项目按5.2.1或5.2.2要求进行。出厂检验不检有效期。

8.3 判定规则

菌肥中有效活菌数的数量是微生物肥料质量关键指标，是一切微生物肥料的产品必须达到的指标。所规定的外观、水分、细度、有机质、pH值作为微生物肥料质量检验参考指标。

对产品是否合格作如下规定：

a)   产品有效活菌数不合格时该产品判定为不合格产品；

b)  有效活菌数合格，杂菌率合格，参考指标四项（包含四项）以上不合格，该产品判定为不合格品；

c)  产品有效活菌数符合指标，杂菌率不符合指标，但小于本标准规定的两倍时参考指标一项不合格者，该产品判定为合格产品；参考指标有两项（含两项）以上不合格者，该产品判定为不合格产品；

   产品有效活菌数符合指标，杂菌率大于本标准规定的两倍；或微生物肥料霉菌数≥6.0×10^-5个/g(mL)，拌种剂霉菌数≥3.0×10^-5个/g(mL),判为不合格产品。

9 包装、标识、运输和贮存

9.1 包装

9.1.1 内包装

液体肥料小包装用塑料瓶或玻璃瓶，大包装用塑料桶。固体肥料用不透明聚乙烯塑料袋包装。颗粒肥料亦可用编制袋包装。

9.1.2 外包装

外包装采用纸箱，纸箱质量应符合GB/T 6543要求。箱外用尼龙打包带加固。

9.1.3 每箱(袋)产品中附有产品合格证和使用说明书，在使用说明中标明使用方法、用量及注意事项。

9.2 标识、运输和贮存

磷细菌肥料的标识、运输和贮存按NY 411-2000中的9.2、9.3和9.4执行。

上一篇：鱼类嗜水气单胞菌灭活疫苗制作规程(2)

下一篇：公共场所毛巾、床上卧具微生物检验方法