组培苗的玻璃化

在进行植物组织培养时，经常会发现试管苗生长异常，表现为试管苗叶、嫩梢呈水晶透明或半透时，水浸状；整株矮小肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲、脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织。这种试管苗生长异常现象就是 P.Debergh（1981）首先命名的“玻璃化”（Vitrification）。是植物组织培养过程中所特有的一种生理失调或生理病变。

      玻璃苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和森质素含量低、角质层、栅栏组织等发育不全，表现为光合能力和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材；生根困难，移栽后也很难成活。植物微体快速繁殖时玻璃苗的出现已成为一种很普遍的现象，该苗有时多达50%以上，严重影响繁殖率的提高，已成为茎尖脱毒、工厂化育苗和材料保存等方面的严重障碍，造成人、财、物的极大浪费，所以试管苗下班化现象对植物组织培养的危害是相当严重的，也是亟待解决的问题。

    （一）玻璃苗发生的因素

      琼脂和蔗糖浓度与玻璃化成负相关，琼脂或蔗糖浓度越高，玻璃苗的比率越低。Daniel&nbspG.&nbspW.&nbspBrown认为玻璃化可能是培养基渗透势不当所致。碳源不仅为芽的形成提供能量，而且也起渗透调节作用，主要影响培养基的渗势（Salisbury等）。随琼脂浓度及纯度的增加，培养基硬度增加，从而影响其衬质势和水分状况。Debergh等研究表明，液体培养基的水势影响玻璃苗的形成，Ziv等认为只要降低培养容器中的相对湿度，就可以降低玻璃苗的比例。刘思颖等（1988）测得丝石竹玻璃苗叶片的水势约为正常苗的1.9倍，含水量为正常苗的2.09倍—2.21倍。自由水和高湿度可能与肉质嫩梢的形成有关。Davis等研究表明，液体培养是导致玻璃化的主要原因。可以断定，试管苗玻璃化可能是培养基内水分状态不适应的一种生理变态。

      许多学者证明培养基中BA浓度和培养温度与玻璃化成正相关，BA浓度越高或培养温度越高，玻璃苗比率越大。 Debergh曾用14C-KT研究表明，随琼脂浓度的增加，KT利用率降低。同时也证明，随BA浓度的增加，玻璃化率增加。Bornman等用14C- BA研究表明，14C-BA的积累与不定芽分化和玻璃化是同步的。玻璃化苗的一个重要特征是叶脉明显加长，而GA3也有类似效应，也许GA3促进了细胞过度生工，从而导致玻璃化。生长素可以改变细胞壁的机械特性，使其具有更大的可塑性。

    许多研究表明，非受伤的物理和化学协迫可以增加乙烯的合成。玻璃化被认为是一种非受伤协迫条件下形态上的反应。玻璃苗苯丙氨酸解氨酶（PAL）的活性低于正常植株。在协迫条件下乙烯的快速合成，又通过抑制氨基环丙烷羧酸（ACC）酶的形成，对乙烯起反馈调节作用。通过改善气体交换防止玻璃化形成，可能与克服乙烯反馈抑制有关。一种与膜有关的过氧化物酶直接或间接掺入ACC合成乙烯。现已证明，IAA-氧化酶体系至少在乙烯合成的最后一步起作用。IAA含量降低将进一步通过IAA调节S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转化成ACC这一过程，从而降低了乙烯形成。Kevers等曾证明，对于玻璃苗，碱性过氧化酶同功酶活性增加，而酸性同功酶活性降低。但总可溶性过氧化物酶活性增加，仅限于碱性提取物。有人认为，玻璃化的形成主要是膜的效应而与核酸无关。乙烯促进了叶绿素分解及细胞的畸形发展。乙烯处理破坏了膜的结构，随着细胞壁解离，细胞内积累有在量纤维素及泡状物质。可见，乙烯对玻璃化的影响，与改变组织的生理生化及纤维结构有关。

      &nbspHakkart&nbspF.&nbspA. 等认为玻璃苗是培养瓶内气体与外界交换不畅造成的。密闭的封瓶口材料是导致玻璃化的原因之一（陈国菊等1992，李云等1996）。

       培养基中高的含N量，特别是高的氨态N，也是导致玻璃化的因素。

      有人发现不同部位的节段外植体与玻璃化有关，以留兰香基部节段所形成的试管苗玻璃苗严重，中部茎段次之，茎尖最好（柴明良）；重瓣丝石竹中部茎段出现玻璃苗较多，基部茎段较少，茎尖没有（郭达初）。郭东红等（1989）认为瑞香茎尖外植体大小与玻璃化相关，茎尖外植体越小，出现玻璃苗比率越大。

    （二）玻璃苗发生的机理

       &nbspKevers 等的试验表明，苹果砧木M7等的玻璃苗是由于过氧化物酶——吲哚乙酸氧化酶系统控制的乙烯过饱和的影响，并认为细胞激动素和NH4+离子的过剩是一种最初的胁迫，受胁迫的试管苗在乙烯过剩的空气中，抑制了乙烯的生物合成，结果降低苯丙氨酸解氨酶（PAL）和酸性过氧化物酶的活性，从而妨碍组织木质化，导致形成玻璃苗。一种诱导协迫（过多的细胞分裂素和NH4+），可以通过酚含量的快速化调节不断增加的过氧化物酶活性。乙烯的大量形成又对其自身起反馈抑制作用，结果PAL和酸性过氧化物酶活性降低，从而抑制木质化过程的进行。糖用于氨基酸的合成，纤维素含量降低。由于缺乏纤维素和木质素，壁压降低，从而细胞过分吸水，并导致玻璃化。

        张洪胜等认为在试管苗玻璃化过程中，作为内源激素的乙烯从代谢调节上起了关键性启动作用。而乙烯的产生则取决于培养环境中的胁迫条件，如水势不当，通气不畅（造成缺氧）及培养基用BA量过高等，均会导致乙烯产生。乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化。因此，发生蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状；张昆瑜等（1991）认为乙烯克服试管苗玻璃化的机理是复杂的，在添加乙烯前体ACC（1-氨基环丙烷-1-羧酸）和乙烯释放剂CEPA（乙烯利）的培养基上证明乙烯对香石竹试管苗干物质积累及组织、器官的发育有利。并发现ACC可促进烟草愈伤组织中的过氧化物酶和苯丙氨酸裂解酶的活性，加强磷酸戊糖途径与抗氰交替途径，前两个酶是促进木质素合成和细胞壁形成的关键酶，磷酸戊糖途径与叶绿素前体的合成有关，抗氰交替途径则降低了ATP的合成，从而抑制了过度主动吸水，提高了蛋白质和干物质的含量。

       李云等（1996）发现植物光呼吸途径和磷酸戊糖（HMP）途径均与玻璃苗的产生有关，即当上述两条呼吸途径的一条或两条同时受阻时，均增加玻璃苗。密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快了生长速度，加剧了瓶中气体组成的改变，对瓶内外气体交换提出更高要求，当这种要求不能满足时便出现玻璃化。HMP途径的中间步骤与戊糖化合物代谢有关（如核酸合成），也与木质素形成有关。当HMP途径被抑制时，壁的再生受抑制，戊糖化合物减少，核酸、蛋白质合成受阻。当光呼吸途径被抑制时，减弱了光呼吸对光合的保护作用，过剩的同化物损坏了光合细胞器，不仅降低了光合作用，同时也阻碍了乙醇酸的的转化，加重了乙醇酸对植物的毒害作用，从而导致玻璃化的产生。

    （三）防止和克服玻璃苗的措施

      尽管关于玻璃化的成因及其生理机制到目前为止仍未得出一致的结论，但对某些植物的玻璃化已得到有效的控制。这些研究表明，控制玻璃化要从培养的环境条件和生理生化方面入手，具体措施如下：

      利用固体培养，增加琼脂浓度，降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏。提高琼脂纯度，也可降低玻璃化。

      适当提高培养基中蔗糖含量或加入渗透剂，降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分，造成水分胁迫。

      降低培养容器内部环境的相对湿度。

      适当降低培养基中细胞分裂素和赤霉素的浓度。

      控制温度适当低温处理，避免过高的培养温度在昼夜变温交替的情况下比恒温效果好。

      增加自然光照。试验发现，玻璃苗放于自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失，因自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。

      增加培养基中Ca、Mg、Mn、K、P、Fe、Cu、Mn元素含量，降低N和Cl元素比例，特别降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量。

     改善培养容器的通风换气条件，如用棉塞或通气好的封口膜封口。

      青霉素G钾（2mg/L—6mg/L）能有效防治菊花试管苗的玻璃化（陈龙清等），青霉素（40万单位/升）可降低芥菜试管苗的玻璃化（陈国菊等）。

      培养基中加入间苯三酚或根皮苷。

      用40℃热击（周菊华等）处理瑞香愈伤组织培养物，可完全消除再生苗的玻璃化，且能够提高愈伤组织的芽分化频率，热击处理会降低内源细胞分裂素水平。

      一些添加物可有效地减轻或防治玻璃化，如王家旺等添加马铃薯汁或活性炭降低了油菜玻璃苗频率；郭达初等用10mg/L—15mg/L的CCC或0.5mg /L—1.0mg/L的PP333减少了重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生；师校欣等（1990）添加1.5g/L-2.0g/L的聚乙烯醇防治苹果砧木玻璃化；张昆瑜等增加容器中乙烯含量克服香石竹玻璃化的发生。

      尽管如此，不同植物在不同条件下，也许会得出不同的结论或相反的结果。更有效的玻璃化控制途径，有等于进一步研究。

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