细菌鞭毛染色方法及其应用（上）

一、细菌鞭毛染色方法

　　目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。

1. 碱性复红法和副品红法：

　　1926年由Gray首创碱性复红法，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml 95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。

　　尽管Leifson方法的试剂可以冷藏保存1～2个月，比Gray法进步了，但Gray法、Leifson法仍存在试剂稳定性较差的问题；并且制备涂片程序亦繁锁，如细菌要接种营养琼脂斜面，制备涂片前要用蛋白胨水悬浮培养物斜面0.5 h，然后用该菌悬液化气制涂片；缺乏对染色效果方法的评价。

　　1976年，Clark在Leifson法的基础上，通过大量试验解决了3个重要问题：首先，制备涂片时可以直接从Columbia琼脂血平板上取菌制备；；其二，可运用打分的方法进行染色效果评价；；其三，首次证明了血平板培养和肉汤培养的细菌鞭毛染色效果无差别。未使用Leifson法中的副品红染色剂，而使用了Gray法中的碱性复红染色剂。

　　具体配方：1.2%碱性复红，1.5%单宁酸和0.75%NaCl，95%乙醇溶解碱性复红后，过夜使用。用1 mol/L NaOH溶液调pH至5，染液需4℃保存，稳定1个月。

　　Clark虽然使用了3分制评分标准评价染色效果，但由于没有解决染色液的稳定性差的问题，仍不够完善。1981年Forbes在前人的基础上对碱性复红法进一步改良其配方：0.4g碱性复红，0.2g单宁酸和0.5g硫酸氨铝，装于16 mm×125 mm的试管中，密闭保存。染色前，用2 ml 95%乙醇，0.5ml甘油，7.5ml Tris缓冲液混合物使其溶解，充分摇动3～5min，2500r/min离心2min，室温反应30min后使用。试管中的混合液加入矿物油后，室温下能保存2周。Gray法、Leifson法及Clark法的染色时间均需要试验摸索，Clark改良法的时间为5～15min，Forbes法则只需1min，但Forbes法对于肠杆菌科的染色效果不理想，除了变形杆菌，评分值都在3分以下。Forbes仍未解决染色试剂稳定性差的问题。

2. 结晶紫法：

　　又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想，至今尚无一篇文献对其方法进行评分评。

3. 维多利亚蓝B法：

　　1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。

4. 镀银染色法：

1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。

媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。

　　银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。

　　用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。

　　试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。

　　媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。

　　2002年谷海瀛发明了一种新的细菌鞭毛镀银染色法。该法将媒染剂分为A、B两种。A液为酸化FeCl3溶液，B液为15%单宁酸，含甲醛1 ml，用时A、B液等量混合，轻微加热，染片40s，再用银染液涂片加热至微冒蒸汽，染色10 s。通过对19个属，34个种，228株细菌进行鞭毛染色，应用West等的染色效果评价方法进行评价。血琼脂平板培养平均每株菌获得4.7分，肉汤培养平均每株菌获得4.6分，其中100株非发酵菌在血平板培养获得满分5分。重要的是这种方法不仅染色效果好，而且解决了试剂稳定性差的问题，此种试剂常温下至少可保存1年。

5. 荧光蛋白染色法：

　　2000年，Grossart等报道了一种荧光蛋白染色法该方法是在玻片上加10μl活细菌液体培养物，再加0.5μl荧光染色剂（nanoOrange），然后加30%聚乙烯吡咯烷酮10～20μl，盖上盖玻片，10～15min后使用放大倍数×1250，激发波长490nm，发射波长520 nm的落射荧光显微镜（epifluores cence microscopy）观察。研究中共检测了37株细菌，其中有动力的6株细菌未观察到鞭毛。这种新方法不适合于在临床微生物实验室常规开展，因为结果观察时必须借助特定的设备，细菌培养必须使用液体培养基，其可靠性还有待进一步验证。

　　综上所述，无论是碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法，还是传统镀银染色法都无法克服试剂不稳定这一最大的缺点。结晶紫法虽然试剂比较稳定，但染色效果却不理想。谷海瀛发明的细菌鞭毛镀银染色法操作简便、快速、试剂稳定、重复性好，可以作为实验室常规鞭毛染色方法推广应用。

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